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CD36在糖尿病肾脏的表达及抗氧化肽SS-31对其干预作用的研究

侯延娟  
【摘要】:目的:在发展中国家,糖尿病是导致慢性肾衰的主要原因之一,在全球范围内拥有很高的发病率和死亡率。在糖尿病引起的微血管并发症中,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病引起终末期慢性肾功能衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)加重患者死亡的重要原因。许多机制参与糖尿病肾病的疾病过程,包括代谢和血流动力学改变,炎症和氧化应激反应,肾素血管紧张素系统的激活等。其中高糖环境诱导的炎症和氧化应激在糖尿病肾病的进展中起到的作用得到越来越多的认可。大量研究显示,活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成增多是糖尿病高血糖环境诱导肾脏形态学及功能损伤的原始动力。在糖尿病肾病肾小管细胞,高糖环境能够促进晚期糖基终末产物(advanced glycation end products,AGEs)生成增加,肾素血管紧张素系统(angiotensin II,Ang II)及蛋白激酶C(Protein kinase,PKC)信号通路的激活等,均可导致ROS生成增加,加重氧化应激反应。同时,越来越多的研究认为,糖尿病高血糖、氧化应激反应等多种因素均能激活炎症相关信号通路,包括细胞粘附分子、生长因子的生成增加、肾脏间质炎症细胞的浸润、前炎症因子的释放。糖尿病肾脏的炎症反应一方面激活JNK、NF-k B及P38MAPK等信号通路,另一方面诱导ROS的生成增多。炎症与氧化应激相互作用,加重肾间质纤维化(Renal Interstitial Fibrosis,RIF),促进肾损害的发生。然而糖尿病肾病肾组织的炎症及氧化应激的发生机制尚未完全阐明。CD36属于B组清道夫受体家族,最早被命名为血小板膜糖蛋白IV,是一种细胞表面单链跨膜糖蛋白。CD36在巨噬细胞、微血管内皮细胞、血小板及上皮细胞等多种细胞表面表达,参与机体的多种生物学过程,具有多种功能。有研究显示,在慢性肾脏疾病、缺血性脑卒中、动脉粥样硬化及代谢紊乱等多种疾病状态下,CD36均能够参与调解炎症反应,介导机体氧化应激。新近的研究发现,白蛋白及AGEs均能够促进肾小管上皮细胞表达CD36,敲除CD36表达能够明显减少白蛋白及AGEs诱导的肾组织炎症及纤维化改变。在高脂饮食喂养的单侧输尿管结扎小鼠模型体内,下调CD36表达能够通过抑制NF-k B等前炎症信号通路,抑制机体炎症反应及ROS生成。而在对糖尿病肾病的研究中同样发现,高糖能够促进肾小管上皮细胞表达CD36,增加的CD36能够通过激活p38MAPK等信号通路参与高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的发生。Yang等则发现,CD36能够通过活化TGF-β1/CTGF等相关信号通路参与糖尿病肾病肾小管间质纤维化的发生。综上可见,CD36与炎症、氧化应激及纤维化改变密切相关,而炎症及氧化应激又是糖尿病肾病发病机制之一,由此我们推断CD36很可能参与糖尿病肾病的发生发展。SS-31(D-Arg-2’,6’-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2)是一种线粒体定位,具有抗氧化作用的小分子肽。通过清除线粒体内过度生成的ROS及抑制线粒体ROS生成,发挥抗氧化作用。有研究证明,在胰岛细胞,SS-31能够抑制线粒体膜电位下降,增加胰岛细胞存活率,抑制胰岛细胞凋亡。在高糖刺激的人视网膜细胞中,SS-31同样能够抑制线粒体ROS生成,稳定细胞线粒体膜电位。在对缺血再灌注脑损伤及单侧输尿管结扎动物模型中研究者发现,SS-31与机体氧化应激关系密切。我们的前期研究也发现,在糖尿病肾病,SS-31能够抑制线粒体ROS生成,保护线粒体功能,减少肾脏细胞凋亡等,从而起到保护肾脏的作用。而新近的研究认为,缺血性脑卒中小鼠体内,SS-31的抗氧化应激作用是通过一个CD36依赖的途径实现的。提示SS-31的抗氧化作用机制可能与CD36相关。因此,在本课题中,我们首先检测了CD36在糖尿病肾脏中的表达情况,进一步应用基因敲除技术敲低CD36表达,观察糖尿病肾小管上皮细胞在炎症、氧化应激及纤维化等方面改变,从而探讨CD36在糖尿病肾病发生、发展中的作用机制。除此之外,我们研究了抗氧化肽SS-31与CD36的关系,为糖尿病肾病治疗提供新靶点。方法:1糖尿病肾病临床患者、db/db小鼠肾脏组织及高糖培养的HK-2细胞中CD36蛋白检测临床患者肾脏标本包括2型糖尿病肾病组(DM group)10例及对照组(control group)10例。其中10例2型糖尿病肾病患者均为经病史、临床检查及肾穿刺活检病理确诊为糖尿病肾病患者。10例对照组来自肾脏肿瘤患者远离肿瘤的瘤旁组织(5cm)。各组肾脏组织常规石蜡包埋、切片。采用H.E染色、PAS染色及Masson染色技术检测各组肾脏病理改变情况。采用免疫组织化学方法检测各组CD36蛋白表达;动物标本收集:8周龄、SPF级、健康、雄性C57BL/ks db/db小鼠(40±2.5g)8只及雄性C57BL/ks db/m对照小鼠(20±2.5g)8只,购自常州卡文斯实验动物有限公司。于温度22±2°C,相对湿度55±2%环境下常规喂养,于小鼠20周龄时处死取材,留取尿液及血清;取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定,用于光镜观察;部分肾皮质组织经液氮速冻后保存于-80°C冰箱,用于提取总蛋白及总RNA进行Western blot和Real-time PCR检测。细胞标本收集:条件永生性人肾小管上皮细胞HK-2细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC,American Type Culture Collection)。于5%CO2,37°C CO2培养箱中培养。将实验HK-2细胞分成2组:正常糖对照组0h(5.5 mmol/L glucose,NG)、高糖组(30 mmol/L glucose,HG)。将各组细胞同步化,高糖组于干预后6h、12h、24h、48h、72 h收集细胞,分别提取各组细胞总蛋白及总RNA进行相关指标的检测。2敲低CD36对高糖诱导的HK-2细胞炎症、氧化应激及转分化的影响制备CD36si RNA,应用Lipofectamine 2000转染试剂将其转染HK-2细胞。将实验HK-2细胞分成5组:正常糖对照组(5.5 mmol/L glucose,NG)、正常糖+高渗对照组(5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose,HG)、高糖+CD36si RNA转染组(30 mmol/L glucose+CD36si RNA,si RNA)、高糖+SSO组(30 mmol/L glucose+0.5m M SSO,SSO)。分别经细胞同步化、分组干预刺激48小时后收集细胞;Western blot检测CD36、NF-k B、Histone3、p-iκB、Total iκB、ERK1/2、p-ERK1/2、Collagen I、Fibronectin、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、CTGF,Smad2、p-Smad2蛋白表达;Real-time PCR检测CD36、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1及CTGF m RNA表达;ELISA检测细胞上清中IL-1β、MCP-1、TNF-α、Collagen I、Fibronectin分泌。细胞免疫荧光染色检测CD36、NF-k B、α-SMA及E-cadherin的表达;流式细胞仪检测ROS。为检测CD36与氧化应激关系,加用细胞及线粒体ROS抑制剂NAC及Tempol,将实验细胞分为6组:正常糖对照组(5.5 mmol/L glucose,NG)、正常糖+高渗对照组(5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose,HG)、高糖+NAC组(30 mmol/L glucose+5 mmol/L N-Acety-L–Gysteine,NAC)、高糖+Tempol组(30 mmol/L glucose+2mmol/L Tempol,Tempol)、高糖+NAC+Tempol组(30 mmol/L glucose+5mmol/L N-Acety-L-Gysteine+2 mmol/L Tempol,NT)分别经细胞同步化、分组干预刺激48小时后收集细胞,应用Western blot及Real-time PCR检测CD36蛋白及m RNA表达。3抗氧化肽SS-31对db/db小鼠肾脏及高糖刺激的HK-2细胞CD36表达的影响动物实验:6~8周龄雄性db/db小鼠随机分为:db/db糖尿病组(db/db)、db/db糖尿病+SS-31药物干预组(db/db+SS-31)。同周龄雄性db/m小鼠作为正常对照组(db/m)及db/m+SS-31药物干预对照组(db/m+SS-31)。db/db+SS-31和db/m+SS-31组以SS-31(3 mg/kg)腹腔注射,每天一次持续12周。每2周检测一次血糖水平。于动物20周龄时处死动物取材,同时记录肾重、体重。留取血和尿标本检测血糖(Glu)、24小时尿蛋白定量(UPE)、肌酐(Scr)。采用PAS染色技术检测各组肾脏病理改变情况。ELISA法检测尿中MDA及8-OHd G含量。Western blot法检测Mn SOD、CAT、NOX4、p22、CD36、NF-κB蛋白表达,Real-time PCR检测Mn SOD、CAT、NOX4、p22、CD36m RNA表达。免疫组织化学染色检测CD36表达。细胞实验:将实验HK-2细胞分成4组:正常糖对照组(5.5 mmol/L glucose,NG)、正常糖+高渗对照组(5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose,HG)、高糖+SS-31药物干预组(30 mmol/L glucose+100n M SS-31,SS-31)。分别经细胞同步化、于刺激48 h后收集细胞。Western blot检测Mn SOD、CAT、NOX4、p22、CD36、NF-κB蛋白表达,Real-time PCR检测Mn SOD、CAT、NOX4、p22、CD36m RNA表达。免疫细胞荧光染色检测各组NF-κB及CD36的表达;流式细胞仪检测线粒体ROS水平。结果:1 CD36在糖尿病肾组织表达情况1对照组肾组织未见明显异常;DN组肾小球体积增大,基底膜弥漫或不规则增厚,细胞外基质增多,部分肾小管上皮细胞出现空泡变性,间质纤维化。2对照组肾组织未见明显CD36表达,与对照组相比,DN组CD36表达明显增加(P0.05),且CD36主要在近端肾小管上皮细胞表达,远端肾小管表达较少,肾小球及肾间质未见明显表达。3db/db组小鼠空腹血糖及肾重/体重增加明显。与db/m组相比,db/db组小鼠血肌酐及24小时尿蛋白量较db/m组均明显增多(P0.05)。4与db/m组相比,db/db组小鼠肾脏CD36蛋白表达及m RNA水平明显增加(P0.05)。CD36表达主要分布在近端肾小管上皮细胞,远端肾小管表达较少,肾小球及肾间质未见明显表达。5CD36蛋白表达及m RNA水平于高糖刺激HK-2细胞6h表达增加,于48h达高峰,呈现时间依赖性,于72h有所下降(P0.05)。CD36于细胞膜表达最多,胞浆线粒体可见部分表达。2敲低CD36对高糖诱导的HK-2细胞炎症及氧化应激的影响1与NG组相比,HG组HK-2细胞上清中炎症因子IL-1β、MCP-1、TNF-α分泌明显增加(P0.05)。而CD36si RNA敲除及CD36抑制剂SSO干预均能够明显抑制高糖诱导的HK-2细胞炎症因子IL-β1、MCP-1、TNF-α的分泌(P0.05)。2与NG组相比,HG组炎症相关信号通路NF-k B、iκB及ERK1/2活化明显增加(P0.05)。CD36si RNA敲除及CD36抑制剂SSO干预均能抑制NF-k B、iκB及ERK1/2活化(P0.05)。3与NG组相比,HG组HK-2细胞线粒体ROS生成明显增加(P0.05)。而与HG组相比,CD36si RNA敲除及CD36抑制剂SSO干预均能抑制高糖诱导的ROS生成增多(P0.05)。4与NG组相比,HG组HK-2细胞CD36蛋白表达及m RNA水平明显增加(P0.05)。与HG组相比。NAC干预、Tempol干预及NAC+Tempol能抑制高糖上调的CD36表达(P0.05)。3敲低CD36对高糖诱导的HK-2细胞转分化的影响1NG组与M组HK-2细胞上皮细胞边界清晰,呈鹅卵石样贴壁生长。HG组与载体对照组HK-2细胞边界不清,胞体狭长;CD36si RNA敲除及应用CD36抑制剂SSO组细胞较HG组细胞形态有所改善。2与NG组相比,HG组HK-2细胞表达及分泌Collagen I及Fibronectin明显增加(P0.05)。与HG组相比,CD36si RNA敲除及CD36抑制剂SSO干预均能抑制高糖诱导的HK-2细胞表达及分泌Collagen I及Fibronectin(P0.05)。3与NG组相比,HG组E-cadherin蛋白表达及m RNA水平明显减少而α-SMA蛋白表达及m RNA水平显著增加(P0.05)。敲低CD36和应用CD36抑制剂SSO干预能够显著抑制HG下调的E-cadherin表达,减少高糖诱导的α-SMA高表达(P0.05)。4与NG组相比,HG糖组TGF-β1及CTGF蛋白表达及m RNA水平显著增加(P0.05)。敲低CD36和应用CD36抑制剂SSO干预能够显著抑制HG诱导的TGF-β1及CTGF过表达(P0.05)。5与NG组相比,高糖组HK-2细胞Smad2磷酸化水平显著升高(P0.05)。CD36敲低组与应用CD36抑制剂SSO干预组细胞Smad2磷酸化水平明显低于高糖组(P0.05)。4抗氧化肽SS-31对db/db小鼠肾脏及高糖刺激的HK-2细胞CD36表达的影响1db/db糖尿病肾病组小鼠肾小球体积轻微增大,基底膜不规则增厚,系膜基质增多,部分肾小管上皮细胞出现空泡变性。db/db糖尿病肾病组小鼠肾重/体重、尿蛋白(Upro)、空腹血糖(FBG)、肌酐(Scr)比db/m对照组小鼠增加(P0.05)。给予抗氧化肽SS-31治疗后FBG未见明显改变。肾重/体重、Scr、Upro与db/db组比较明显降低(P0.05)。2与db/m对照组相比,db/db糖尿病肾病组小鼠尿中MDA及8-OHd G含量明显增加,抗氧化肽SS-31干预能够明显减少小鼠尿MDA及8-OHd G含量。3与db/m对照组相比,db/db糖尿病肾病组小鼠肾组织Mn SOD及CAT蛋白表达及m RNA水平明显抑制,NOX4、p22及CD36蛋白表达和m RNA水平上升,NF-κB活化增加。抗氧化肽SS-31药物干预能够上调糖尿病状态下抑制的Mn SOD及CAT蛋白表达及m RNA水平,抑制糖尿病肾脏高表达的NOX4、p22、CD36蛋白表达和m RNA水平及NF-κB活化。4与NG组相比,HG组ROS生成增多。与HG组相比,SS-31药物干预能够抑制ROS生成(P0.05)。5与NG组相比,HG组Mn SOD及CAT蛋白表达及m RNA水平明显降低,NOX4、p22、CD36表达及NF-κB活化增加。抗氧化肽SS-31药物干预能够上调高糖抑制的Mn SOD及CAT蛋白表达及m RNA水平,抑制高糖诱导的NOX4、p22、CD36过表达及NF-κB活化(P0.05)。结论:1在2型糖尿病肾病临床患者肾小管上皮细胞、2型糖尿病db/db小鼠肾小管上皮细胞及高糖培养的HK-2细胞中CD36表达增加,且与糖尿病肾脏肾功能水平相关。提示CD36可能参与肾小管上皮细胞损伤过程。2敲低CD36及CD36抑制剂SSO干预能够减少高糖条件下HK-2细胞炎症因子分泌,同时抑制炎症相关信号通路的活化。提示,CD36过表达与高糖诱导肾小管上皮细胞炎症状态相关。3敲低CD36及CD36抑制剂SSO干预能够减少高糖条件下HK-2细胞ROS生成,抗氧化剂NAC和(或)Tempol预均能下调高糖诱导的HK-2细胞CD36过表达。提示,在肾小管上皮细胞,高糖可能通过ROS途径上调CD36表达,CD36过表达进一步加重高糖诱导的ROS生成。4敲低CD36及CD36抑制剂SSO干预能够减少高糖条件下HK-2细胞Collagen I、Fibronectin的表达及分泌,同时抑制HK-2细胞EMT。减少EMT相关信号通路TGF-β1/CTGF及Smad2信号通路的活化。提示,CD36过表达与高糖诱导肾小管上皮细胞EMT相关。5抗氧化肽SS-31能够减少糖尿病肾病小鼠肾脏肥大,改善血尿生化指标水平。SS-31抑制糖尿病肾病小鼠及高糖培养的HK-2细胞氧化应激水平、NADPH氧化酶的激活、CD36过表达及NF-κB的活化,促进Mn SOD及CAT的激活。提示,抗氧化肽SS-31对糖尿病肾脏具有保护作用,且可能是通过下调CD36相关途径实现的。


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