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人牙龈成纤维细胞构建组织工程化血管的实验研究

刘旭倩  
【摘要】:第一部分人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究目的:体外分离培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)诱导分化为血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)。探讨人牙龈成纤维细胞(HGFs)在体外分化为血管内皮细胞(VEC)的潜能。方法:1牙龈组织的获取和分离正常人牙龈组织取自河北医科大学口腔医院口腔颌面外科,患者下颌阻生齿拔除术。牙龈组织手术切取后带回实验室,在无菌条件下分离牙龈上皮及结缔组织,留取牙龈结缔组织进行细胞培养。2人牙龈成纤维细胞(HGFs)的培养培养液选用含15%胎牛血清的L-DMEM。牙龈结缔组织剪成1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养。培养的细胞达到80%融合后,进行细胞传代培养。3人牙龈成纤维细胞(HGFs)的鉴定3.1流式细胞仪检测人牙龈成纤维细胞(HGFs),选择波形蛋白(vimentin)抗体和CD31抗体鉴定成纤维细胞和血管内皮细胞。3.2人牙龈成纤维细胞(HGFs)的RT-PCR鉴定TRIzol法提取成纤维细胞的总RNA;以分光光度计测定细胞总RNA的纯度及浓度;应用反转录试剂盒RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA;以适量反转录所得的cDNA为模版,在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增;将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳,然后置于凝胶图像分析系统进行吸光度扫描,以GAPDH作为内参照校正,用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。3.3人牙龈成纤维细胞(hgfs)免疫细胞化学染色采用鼠抗人vimentin单克隆抗体、鼠抗人iii型胶原单克隆抗体,通过免疫细胞化学染色法检测vimentin蛋白和iii型胶原蛋白在人牙龈成纤维细胞中的表达与分布。3.4人牙龈成纤维细胞(hgfs)免疫荧光染色采用兔抗人s-100a4抗体和鼠抗人肌动蛋白α(α-sma)抗体,通过免疫荧光染色法检测s-100a4蛋白和α-sma蛋白在人牙龈成纤维细胞hgfs中的表达与分布。4生长曲线的测定采用mtt法测定第1~6代人牙龈成纤维细胞(hgfs)1~7天的od490nm处的吸光值。5内皮细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞(hgfs)中的表达采用vimentin,血管生成素受体2(tie2)抗体和血管生长因子受体2(vegfr2)抗体,通过westernblot半定量vimentin蛋白,tie2蛋白和vegfr2蛋白在不同vegf165浓度组和不同诱导周期组中的表达量。real-timepcr相对定量法检测不同vegf165浓度组和不同诱导周期组中vimentin基因,tie2基因,血管生成素2(ang2)基因的mrna相对表达量。6诱导过程中的形态学观察倒置显微镜观察8ng/mlvegf165诱导人牙龈成纤维细胞(hgfs)0,7,14,21,28,35,42和50天时的形态学变化。7诱导后血管内皮样细胞的鉴定7.1免疫细胞化学染色8ng/mlvegf165诱导人牙龈成纤维细胞35天后,采用鼠抗人cd34单克隆抗体、鼠抗人cd31单克隆抗体,通过免疫细胞化学染色法检测cd34蛋白和cd31蛋白在诱导后血管内皮样细胞的表达与分布。7.2免疫荧光染色8ng/mlvegf165诱导人牙龈成纤维细胞35天后,采用血管性假血友病因子(vwf)抗体和上皮钙粘附分子(e-cadherin)抗体,通过免疫荧光染色检测vwf蛋白和e-cadherin蛋白在诱导后血管内皮样细胞的表达与分布。7.3rt-pcr鉴定诱导后血管内皮样细胞中tie2基因的mrna相对表达量。7.4经8ng/mlvegf诱导35天后,通过透射电镜观察诱导后血管内皮样细胞的超微结构。8流式细胞仪测定诱导细胞转化率采用cd34抗体和cd31抗体,通过流式细胞仪检测诱导后血管内皮细胞中cd34和cd31的阳性表达率,以评估人牙龈成纤维细胞(hgfs)分化为血管内皮细胞(vec)的转化率。9成管能力测试检测诱导后血管内皮细胞的功能将诱导前后细胞接种于24孔板的matrigel基质胶中,olympusix71倒置显微镜下观察管状排列结构和完整度并计数管状结构的数量,对诱导后血管内皮细胞(vec)的功能进行评估。结果:1人牙龈成纤维细胞(hgfs)的基本生长情况细胞多数呈长梭形,细胞核较大,呈圆形或椭圆形。原代培养以组织块为中心向周围辐射生长,传代培养的细胞生长状态好,3~4天即可生长达90%~100%。2人牙龈成纤维细胞(hgfs)的鉴定结果2.1流式细胞仪检测人牙龈成纤维细胞(hgfs)表面抗原vimentin和cd31表达结果培养的成纤维样细胞表面抗原vimentin表达阳性,阳性率为(97.13±0.62)%;而表面抗原cd31表达率仅为(8.64±1.55)%。两者比较有统计学差异(p0.05)。2.2细胞rt-pcr鉴定结果细胞rt-pcr结果显示人牙龈成纤维细胞(hgfs)特异性表达vimentin,s-100a4和α-sma。然而,tie2在细胞中不表达。2.3细胞的免疫细胞化学鉴定结果鼠抗人vimentin单克隆抗体和鼠抗人iii型胶原单克隆抗体染色结果显示细胞呈阳性反应。2.4细胞的免疫荧光染色鉴定结果兔抗人s-100a4多克隆抗体和鼠抗人α-sma单克隆抗体荧光染色结果显示细胞分别呈绿色荧光和红色荧光表达。3人牙龈成纤维细胞(hgfs)生长曲线测定结果结果显示第2代或第3代人牙龈成纤维细胞(hgfs)的对数生长期比其余代次细胞增殖水平显著升高(p0.05),而第2代或第3代细胞的对数生长期细胞增殖水平无统计学差异(p0.05)。4内皮细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞(hgfs)中的表达westernblot结果显示,8ng/mlvegf165诱导时tie2蛋白和vegfr2的相对表达量最高。real-timepcr结果显示,经8ng/mlvegf165诱导时tie2基因和ang2基因的mrna相对表达量达到最高。westernblot结果显示,诱导周期达到35天时tie2蛋白和vegfr2蛋白的相对表达含量最高。real-timepcr结果显示,诱导周期达到35天时tie2和ang2基因的mrna相对表达量最高。5vegf165对诱导后细胞形态学的影响人牙龈成纤维细胞(hgfs)经8ng/mlvegf165诱导7~14天,大部分细胞仍然呈现丛状或束状排列;14~21天时,细胞逐渐排列形成多边形上皮细胞样结构;21~28天时,细胞逐渐出现融合成簇现象,逐渐形成鹅卵石样或铺路石样的生长排列形式;28~35天时,绝大多数细胞呈现铺路石样的生长形式以及形成血管腔样结构。6免疫细胞化学染色对诱导后细胞的鉴定鼠抗人cd34单克隆抗体和鼠抗人cd31单克隆抗体染色结果显示细胞呈阳性反应。7rt-pcr鉴定诱导后细胞tie2基因的表达rt-pcr结果显示,与对照组相比,tie2基因在诱导后细胞中显著表达。8免疫荧光染色对诱导后细胞的鉴定兔抗人vwf抗体和兔抗人e-cadherin抗体荧光染色结果显示细胞分别呈红色荧光表达。9诱导后细胞超微结构的观察透射电镜观察显示,细胞表面呈现微绒毛结构,细胞胞浆内出现溶酶体结构及内皮细胞特有的weibel-palad小体(w-p小体)。10流式细胞仪检测分析人牙龈成纤维细胞(hgfs)向血管内皮细胞(vec)分化的转分化率诱导后细胞组cd34和cd31细胞表型阳性率与对照组相比,差异有显著性,具有统计学意义(p0.05)。11成管能力测试实验比较诱导前后细胞形成小管的能力诱导形成的细胞组在matrigel基质胶中24小时呈现管状样结构,与对照组相比,诱导组成管数目显著增高,具有统计学差异(p0.05)。第二部分人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管平滑肌细胞的研究目的:体外分离培养人牙龈成纤维细胞(humangingivalfibroblasts,hgfs)并诱导分化为血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,vsmc),证实人牙龈成纤维细胞(hgfs)具有在体外分化为血管平滑肌细胞(vsmc)的潜能。方法:1人牙龈组织的获取,分离和细胞的培养同第一部分。2人牙龈成纤维细胞(hgfs)的鉴定2.1人牙龈成纤维细胞(hgfs)的rt-pcr鉴定同第一部分。2.2人牙龈成纤维细胞(hgfs)免疫细胞化学染色同第一部分。2.3人牙龈成纤维细胞(hgfs)免疫荧光染色同第一部分。3生长曲线的测定同第一部分。4平滑肌细胞相关标记物在诱导分化中的人牙龈成纤维细胞(hgfs)中的表达采用波形蛋白(vimentin),肌动蛋白α(α-sma)和肌球蛋白(sm-mhc)抗体,通过westernblot半定量vimentin蛋白,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白在不同pdgf-bb浓度组和不同诱导周期组中的表达量。real-timepcr相对定量法检测不同pdgf-bb浓度组和不同诱导周期组中vimentin基因,α-sma基因,sm-mhc基因,calponin1(cnn1)基因和平滑肌22α(sm22α)基因的mrna相对表达量。5诱导过程中细胞的形态学观察倒置显微镜观察10ng/mlpdgf-bb(含2ng/mltgf-β1)诱导人牙龈成纤维细胞(hgfs)0,7,14,21,28和35天时的形态学变化。6诱导后细胞的鉴定6.110ng/mlpdgf-bb(含2ng/mltgf-β1)诱导人牙龈成纤维细胞(hgfs)28天后,采用兔抗人α-sma抗体和鼠抗人sm-mhc抗体,通过免疫细胞化学染色法检测α-sma蛋白和sm-mhc蛋白在诱导后血管平滑肌样细胞的表达与分布。6.2采用cnn1抗体和sm22α抗体,通过免疫荧光染色检测cnn1蛋白和sm22α蛋白在诱导后血管平滑肌样细胞的表达与分布。6.3rt-pcr鉴定诱导后细胞中α-sma基因和sm-mhc基因的表达量。6.4经10ng/mlpdgf-bb(含2ng/mltgf-β1)诱导人牙龈成纤维细胞(hgfs)28天后,通过透射电镜观察诱导后细胞的超微结构。结果:1人牙龈成纤维细胞(hgfs)的基本生长情况:结果同第一部分。2人牙龈成纤维细胞(hgfs)的鉴定2.1细胞rt-pcr的鉴定细胞特异性表达vimentin基因和s-100a4基因,弱表达α-sma基因,不表达sm-mhc基因。2.2细胞的免疫细胞化学鉴定:结果同第一部分。2.3细胞的免疫荧光染色鉴定:结果同第一部分。3人牙龈成纤维细胞(hgfs)生长曲线的测定结果:结果同第一部分。4平滑肌细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞(hgfs)中的表达westernblot结果显示,诱导浓度达到10ng/mlpdgf-bb时,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白的相对表达量最大;诱导周期达到28天时,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白的相对表达含量最高。real-timepcr结果显示,当经10ng/mlpdgf-bb诱导时α-sma基因,sm-mhc基因,cnn1基因和sm22α基因的mrna相对表达量最高;诱导周期达到28天时,α-sma基因,sm-mhc基因,cnn1基因,sm22α基因的mrna相对表达量最高。5诱导过程中细胞的形态学观察人牙龈成纤维细胞(hgfs)经10ng/mlpdgf-bb(含2ng/mltgf-β1)诱导0~7天,大部分细胞仍然呈现丛状;7~21天时,部分细胞呈现凋亡状态,细胞数量呈现一段时间的减少状态,但仍然为丛状排列;21~28天时,细胞伸出伪足并相互连接,在密集与稀疏处相互交错略呈“峰谷”状,可与成纤维细胞相鉴别;28~35天,绝大多数细胞已呈典型的“峰谷”状生长排列方式。6免疫细胞化学染色对诱导后细胞的鉴定结果显示,诱导后细胞兔抗人α-sma抗体呈强阳性反应,鼠抗人sm-mhc抗体呈阳性反应。对照组α-sma仍呈阳性反应,sm-mhc单克隆抗体呈阴性反应。7免疫荧光染色对诱导后细胞的鉴定结果显示,诱导后细胞sm22α抗体和cnn1抗体分别经rhodamine和fitc荧光染色呈阳性反应,胞浆分别呈红色荧光和绿色荧光表达。8细胞rt-pcr检测诱导后细胞α-sma和sm-mhc基因的表达诱导组α-sma基因mrna的相对含量明显高于未诱导组,具有统计学差异(p0.05);诱导组sm-mhc基因mrna的相对含量明显高于未诱导组,具有统计学差异(p0.05)。9诱导后细胞超微结构观察结果透射电镜观察可见胞浆中有少量高尔基复合体,线粒体,粗面内质网,大量粗细不一的肌丝样结构或肌丝束以及电子密度较高的密体样结构等。第三部分兔脱细胞血管基质联合类人Ι型胶原合成支架材料的生物学特性及其细胞相容性的研究目的:应用冻干技术将类人i型胶原蛋白(human-likecollageni,hlc-i)合成高分子材料与兔脱细胞血管基质(acellularvascularmatrix,acvm)支架材料复合,制备acvm-0.25%hlc-i血管支架材料,探讨其生物学特性及与细胞的相容性。方法:1acvm基质的制备称量家兔体重,注射麻醉并结扎预取动脉分支,迅速切取血管,浸入生理盐水中,冲洗管腔后浸入含有1%苯扎溴铵的pbs复合液中60分钟,冲洗后0.1%胰蛋白酶处理6小时,冲洗后移入1%tritonx-100中72小时,制备的acvm基质浸入pbs中保存于4?c冰箱。2acvm基质he染色,观察脱细胞情况。3acvm基质masson染色,观察脱细胞情况及acvm基质中的胶原成分。4acvm与hlc-i的复合丙烯酸预处理acvm基质,紫外灯辐射30分钟,蒸馏水洗净数次后放入真空干燥器中;预处理acvm浸入到碳化二亚胺水溶性中,4oc冰箱中1小时;将不同浓度hlc-i(0.10mg/ml,0.25mg/ml,0.50mg/ml,0.75mg/ml,1.00mg/ml)复合于acvm基质表面12小时;清洗后acvm-hlc-i支架减压干燥,4oc保存备用。5人牙龈成纤维细胞(hgfs)的培养扩增及鉴定,实验方法同第一部分。6mtt法测定hlc-i与acvm的交联的最佳浓度在不同浓度acvm-hlc-i支架上接种人牙龈成纤维细胞(hgfs),分别培养1,4,7天时测量各孔od490nm的吸光值,以确定hlc-i与acvm基质交联的最佳浓度。7支架的吸水性测试实验分为两组,acvm-0.25%hlc-i支架组和acvm支架组,室温条件下,分别称量两组材料浸入pbs前后的重量,干燥状态下重量标记为w0,浸湿24小时后重量标记为w1。支架材料的吸水量百分比计算公式:w1-w0/w0×100%。8支架的力学性能测定采用zwick/roellz020型万能力学实验机来检测标本的拉伸强度,断裂强度和断裂伸长率。实验分为未脱细胞的兔血管组,单纯acvm支架组和acvm-0.25%hlc-i支架组进行检测,记录应力和应变,绘制出应力-应变曲线。9支架的压力爆破实验实验分为未脱细胞的兔血管组,单纯acvm支架组和acvm-0.25%hlc-i支架组。用注满生理盐水的压力枪进行压力爆破实验。10扫描电镜观察支架表面结构a组为未脱细胞的血管组织;b组为acvm支架;c组为acvm-0.25%hlc-i支架,分别观察支架的侧面和内面。11cck-8试剂盒检测acvm-0.25%hlc-i支架的体外细胞毒性待测样品分为acvm-0.25%hlc-i支架组和单纯acvm支架组,铺于96孔板中,与100μl细胞悬液培养24,48和72小时,用cck-8试剂盒进行检测,酶标仪测定各组在450nm处的吸光度,通过计算细胞毒性活力(%),即相对生长率来评价支架的体外细胞毒性。结果:1acvm基质大体观察结果acvm基质呈乳白色,管腔塌陷,管壁变薄,弹性消失并可折叠。2he染色观察acvm基质脱细胞程度结果显示,内膜层呈现透明状,无蓝染细胞核及细胞碎片等残留物,中膜层已经无平滑肌细胞结构,未见蓝染细胞核及细胞碎片等物质,整个管壁变薄,纤维结构稀疏。3masson染色观察acvm基质胶原成分及脱细胞程度结果显示,acvm基质中血管内皮细胞,血管平滑肌细胞和大部分肌纤维等成分脱落,大部分为染成绿色的胶原纤维和少量染成红色的肌纤维,但纤维结构稀疏。4人牙龈成纤维细胞(humangingivalfibroblasts,hgfs)的培养、传代及鉴定结果结果同第一部分。5mtt法测定hlc-i与acvm支架的最佳复合浓度细胞接种于不同浓度hlc-i复合的acvm支架后经1,4和7天培养后,mtt实验结果显示,0.25%hlc-i复合于acvm支架上更有利于细胞的增殖,即为acvm-0.25%hlc-i支架。6acvm-0.25%hlc-i的吸水性测试结果结果显示,acvm-0.25%hlc-i支架与acvm支架相比,吸水能力无差别,二者无统计学差异(p0.05)。7acvm-0.25%hlc-i支架材料的生物力学测定结果acvm-0.25%hlc-i支架的应力和应变均大于acvm支架,而与未脱细胞兔血管无统计学差异。acvm-0.25%hlc-i支架的抗拉伸能力与未处理的天然兔血管更加接近,而acvm支架的抗拉伸能力最差。acvm-0.25%hlc-i支架的断裂强度和断裂伸长率均与未处理的天然兔血管相近,而acvm支架断裂强度与未处理的天然兔血管相比有所降低,其断裂伸长率却有所增加。8acvm-0.25%hlc-i支架材料的压力爆破实验结果acvm-0.25%hlc-i支架的爆破压力大于单纯acvm基质的爆破压力(p0.05);而acvm-0.25%hlc-i支架与未经脱细胞处理兔血管的爆破压力无差别(p0.05)。9扫描电镜观察acvm-0.25%hlc-i支架表面结构的超微结构经0.25%的hlc-i复合后,扫描电镜可见acvm-0.25%hlc-i支架与acvm基质相比,纤维更加致密,内膜层,中膜层和外膜层分界不清,各层均未见细胞分布。10acvm-0.25%hlc-i支架的体外细胞毒性测试结果acvm-0.25%hlc-i支架和acvm支架的相对生长率(rgr)在24,48和72小时时各时间点均在75%以上,acvm-0.25%hlc-i支架和acvm支架的体外细胞毒性评估均合格。随着时间的增加(24,48和72小时),细胞在两种支架材料上的增殖情况为逐渐上升的趋势。第四部分体外构建组织工程化血管及裸鼠体内动态强化的研究目的:采用分层方式将人牙龈成纤维细胞(humangingivalfibroblasts,hgfs)诱导分化形成的血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,vsmc)和血管内皮细胞(vascularendothelialcell,vec)种植于acvm-0.25%hlc-i支架上构建初级组织工程化血管,再将初级组织工程化血管埋植于裸鼠皮下进行动物体内动态强化实验,探讨人牙龈成纤维细胞(hgfs)联合acvm-0.25%hlc-i支架构建组织工程化血管的可行性及裸鼠体内作用力对构建的组织工程化血管的影响。方法:1acvm-0.25%hlc-i支架材料的制备与处理,实验方法同第三部分。2acvm-0.25%hlc-i支架材料的消毒处理3eduapollo488标记诱导形成的血管平滑肌细胞(vsmc)和血管内皮细胞(vec)及鉴定标记率4eduapollo488标记血管平滑肌细胞(vsmc)并种植于acvm-0.25%hlc-i支架采用多次沉淀法将eduapollo488标记的诱导血管平滑肌细胞(vsmc)(1×106/ml)种植于acvm-0.25%hlc-i支架上,连续培养7天。5dapi标记诱导形成的血管内皮细胞(vec)及荧光显微镜下观察标记率6凝胶法种植诱导的血管内皮细胞(vec)将dapi标记的血管内皮细胞(vec)与matrigel基质按照4:1的比例混合制备成vecs-matrigel凝胶,均匀涂抹于种植有vsmcs-acvm-0.25%hlc-i支架材料的表面,置于37?c,5%co2的培养箱内,12小时后加入含15%fbs的1640:l-dmem=1:1的培养液,连续培养3天。7种子细胞种植支架后he染色观察8种子细胞种植支架后免疫组化染色兔抗人肌动蛋白(α-sma)抗体或鼠抗人肌球蛋白(sm-mhc)抗体特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架上的血管平滑肌细胞(vsmc)。鼠抗人cd34抗体和鼠抗人cd31抗体特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架表面生长的血管内皮细胞(vec)。9种子细胞种植支架后免疫荧光染色9.1免疫荧光单标鉴定calponin1(cnn1)蛋白和平滑肌22α(sm22α)蛋白特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架表面及内部生长的血管平滑肌细胞(vsmc),荧光二抗采用fitc;血管性假血友病因子(vwf)蛋白和上皮钙粘附分子(e-cadherin)蛋白特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架表面生长的血管内皮细胞(vec),荧光二抗采用rhodamine,激光扫描共聚焦显微镜采集图像。9.2免疫荧光双标鉴定一抗采用兔抗人sm22α抗体和鼠抗人vwf抗体或鼠抗人cnn1抗体和兔抗人e-cadherin抗体;一抗采用兔抗人α-sma抗体和鼠抗人cd34抗体或鼠抗人sm-mhc抗体和兔抗人cd31抗体;荧光二抗采用山羊抗鼠rhodamine和山羊抗兔fitc或山羊抗兔rodamine和山羊抗鼠fitc进行免疫荧光双标。同时标记acvm-0.25%hlc-i支架上的两种细胞。10扫描电镜观察11裸鼠体内动态强化实验将单纯acvm-0.25%hlc-i支架组和构建的血管组植入裸鼠皮下。分别于术后第3、6、9周再次麻醉动物,取出植入皮下的组织进行固定,行组织学观察,荧光染色观察和压力承受实验测定。11.1组织学观察11.2eduapollo488和dapi荧光染色示踪细胞11.3压力承受实验测定实验分为裸鼠体内埋植的单纯acvm-0.25%hlc-i支架组,构建的血管组和正常血管组,用注满生理盐水的压力枪进行压力爆破实验。结果:1细胞示踪标记率结果eduapollo488标记的诱导血管平滑肌细胞(vsmc)和血管内皮细胞(vec)在荧光显微镜下可见90%以上的细胞被标记上;经dapi标记的诱导血管内皮细胞(vec)在荧光显微镜下可见90%以上的细胞被标记上。2体外构建组织工程化血管2.1he染色观察单独种植诱导的血管平滑肌细胞(vsmc)于acvm-0.25%hlc-i支架时,可见细胞在支架材料内部及表面均匀生长;单独种植诱导的血管内皮细胞(vec)于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架表面时,细胞单层排列分布于支架表面;种植两种细胞于acvm-0.25%hlc-i支架时可见内层为诱导血管内皮细胞(vec)层,中间为matrigel-vsmcs层,最外层为纤维支架层。2.2免疫组化染色结果单独种植诱导的血管平滑肌细胞(vsmc)于acvm-0.25%hlc-i支架时,细胞呈α-sma和sm-mhc抗原阳性反应。单独种植诱导的血管内皮细胞(vec)于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架时,细胞呈cd34和cd31抗原阳性反应。2.3免疫荧光染色结果2.3.1免疫荧光单标结果单独种植诱导的血管平滑肌细胞(vsmc)于acvm-0.25%hlc-i支架时,cnn1和sm22α抗原阳性反应,支架内部和表面的细胞被fitc染成绿色荧光,细胞核被dapi染成蓝色。单独种植诱导的血管内皮细胞(vec)于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架时,vwf和e-cadherin抗原阳性反应,支架表面的细胞被rhodamine染成红色荧光,细胞核被dapi染成蓝色。2.3.2免疫荧光双标结果分层种植于acvm-0.25%hlc-i支架的种子细胞中,支架材料内部的细胞sm22α,cnn1,α-sma或sm-mhc抗原阳性反应,胞浆fitc呈绿色荧光表达,表面的部分细胞vwf,e-cadherin,cd34或cd31抗原阳性反应,胞浆rhodamine呈红色荧光表达,细胞核均被dapi染成蓝色。2.4扫描电镜观察结果结果显示,横断面尚可见双层细胞结构,内表面可见诱导形成的血管内皮细胞(vec)均匀分布且与支架具有良好的生物相容性,细胞与细胞之间呈铺路石样结构。3裸鼠体内动态强化实验结果3.1标本大体观察3周时,单纯支架组和细胞支架组均位于裸鼠的皮下,周围有极薄的裸鼠组织包裹,管腔坍塌,管腔中间有少量裸鼠组织长入;6周时,管型结构完整,裸鼠组织长入,使得管壁相对增厚,管腔中间有裸鼠组织长入;9周时,管型结构仍然完整,周围和中间的裸鼠组织包裹增厚更明显。3.2组织学观察he染色可见,3周时,单纯支架组管壁结构清晰,周围有少量纤维组织包绕和少量炎细胞浸润;细胞支架组管壁中有大量种植细胞和少量裸鼠细胞长入,周围有少量纤维组织包绕和大量炎细胞浸润。6周时,单纯支架组有少量降解,管壁中有裸鼠细胞长入,周围少量炎细胞浸润;细胞支架组管壁中有大量细胞,结构清晰,周围有纤维组织包绕,炎细胞浸润减少。9周时,单纯支架组逐渐降解,周围有大量纤维结缔组织包绕和少量炎细胞浸润;细胞支架组管壁仍然十分清晰,管壁中有大量细胞,大部分来源于诱导形成的血管平滑肌细胞(vsmc)和血管内皮细胞(vec),少数来源于裸鼠细胞的长入,周围少量纤维组织包绕,炎细胞浸润几乎看不到。3.3eduapollo488和dapi荧光染色示踪细胞结果实验组裸鼠皮下植入培养9周后,acvm-0.25%hlc-i支架上诱导血管平滑肌细胞(vsmc)被eduapollo488标记呈绿色荧光,诱导血管内皮细胞(vec)被eduapollo488标记呈绿色荧光,同时被dapi标记呈蓝色荧光,证实这些细胞来源于之前种植于支架的种子细胞。3.4压力承受实验测定结果acvm-0.25%hlc-i支架组与组织工程化血管组相比,具有统计学差异(p0.05);组织工程化血管组与正常血管组相比,无统计学差异(p0.05)结论:1人牙龈成纤维细胞(hgfs)能在体外诱导分化为血管内皮细胞(vec)。2人牙龈成纤维细胞(hgfs)能在体外诱导分化为血管平滑肌细胞(vsmc)。3类人i型胶原蛋白(hlc-i)与兔脱细胞血管基质(acvm)联合制备的acvm-0.25%hlc-i支架材料具备充分的促进细胞粘附,细胞增殖和细胞迁移能力以及良好的机械性和生物力学性能。4人牙龈成纤维细胞(hgfs)诱导分化为血管平滑肌细胞(vsmc)和血管内皮细胞(vec),分层种植于acvm-0.25%hlc-i支架材料上,体外能够成功构建组织工程化血管组织。5裸鼠体内强化实验证实,由人牙龈成纤维细胞(hgfs)诱导分化的血管内皮细胞(vec)和血管平滑肌细胞(vsmc)联合acvm-0.25%hlc-i支架材料,在裸鼠体内生长9周,构建的组织工程化血管组织形态完好。


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