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黄芪甲苷对TL1A高表达慢性实验性结肠炎小鼠IL-9表达的影响

吴梦瑶  
【摘要】:炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)发病机制尚不十分明确,目前认为肠黏膜免疫异常是IBD的重要病因之一,而CD4+T细胞是其免疫应答的主要效应细胞,在维持IBD免疫平衡中发挥着重要作用。Th9细胞是一种新发现的CD4+T细胞亚群,主要分泌IL-9,近年研究发现,Th9细胞及IL-9在IBD发生发展中起着关键作用,受到越来越多的关注。IL-9具有广泛的生物学活性,在过敏性疾病、类风湿关节炎等多种自身免疫性疾病中发挥重要作用。尽管Th9细胞在诸多自身免疫疾病中发挥重要作用,但目前有关Th9细胞在IBD领域的研究报道不多。研究发现,Th9细胞与IL-9水平在UC患者和动物结肠炎模型中均明显升高,并且与结肠炎病情严重程度呈正相关。应用IL-9基因敲除小鼠制备的实验性结肠炎模型肠道炎症程度较WT组轻;应用抗IL-9抗体腹腔注射治疗急性结肠炎小鼠后,肠道炎症下降。这些研究提示Th9细胞及其分泌的IL-9在IBD发病机制中可能发挥重要作用。肿瘤坏死因子样配体1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule1A,TL1A)是新近发现的一种肿瘤坏死因子家族新成员,与死亡受体3(death receptor 3,DR3)结合,引发肠道炎症反应。目前,TL1A调控Th9细胞功能的研究报道不多,在过敏性肺炎的研究中发现,TL1A刺激Na?ve CD4+T细胞可促进其向Th9分化,产生IL-9增多。在IBD领域,TL1A与Th9细胞及IL-9的关系尚未研究报道。黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)是黄芪(Astragalus membranaceus)药理活性的主要物质之一。黄芪在IBD的治疗中应用较为广泛,治疗UC已被证实有效。研究发现,TL1A在病毒性心肌炎中的表达升高,应用AS-Ⅳ的干预后,能够明显下调TL1A表达,从而减轻心肌损害。目前尚无AS-Ⅳ与TL1A在IBD领域的研究。目的:探讨AS-Ⅳ对TL1A高表达慢性实验性结肠炎小鼠的治疗作用,明确AS-Ⅳ能否通过下调TL1A表达,抑制IL-9产生,以期为临床IBD的治疗提供一种新的有效药物。方法:1采用real-time Q-PCR方法进行LCK-CD2-TL1A-GFP基因型小鼠的鉴定与筛选。2通过硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium,DSS)建立慢性实验性结肠炎模型,将L-Tg小鼠与C57BL/6WT小鼠(体重20~22g,8-10周)分别随机分为Control组、DSS组、AS-Ⅳlow dose组(20mg/kg.d)、AS-Ⅳhigh dose组(30mg/kg.d),每组10只。正常对照组引用蒸馏水,DSS组、AS-Ⅳlow dose组和AS-Ⅳhigh dose组间断饮用2%DSS,饮用DSS的时间段分别为第1~5天、第8~12天、第15~19天、第22~26天,第27、28天及其余时间饮用蒸馏水,共四周。AS-Ⅳlow dose组和AS-Ⅳhigh dose组第14天开始给予黄芪甲苷灌胃治疗。3每天观察小鼠的一般状况、体重变化、进食以及大便情况,并评估疾病活动指数(Disease activity index,DAI)。4观察结肠形态学变化,测量结肠的长度,计算结肠形态学评分以及组织病理学评分和结肠组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)含量。5应用Western blot技术和real-time Q-PCR技术分别检测结肠组织中TL1A、DR3和IL-9蛋白及m RNA的表达水平。6提取肠黏膜固有层单个核细胞(Lamina propria mononuclear cells,LPMC),肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes,MLN)以及脾脏中的单个核细胞并计数,应用流式细胞术(Flow cytometry,FC)检测Th9细胞占CD4+T细胞比例,应用酶联吸附反应试验(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测细胞上清液及血清中的IL-9的水平。结果:(1)根据基因LCK-CD2-TL1A-GFP序列测定小鼠DNA,Tg小鼠目的基因测定成像在192 bp位置,而WT小鼠基因测定成像,在192 bp位置没有检测到目的基因,据此筛选并鉴定Tg小鼠。(2)与Control组相比,WT和Tg小鼠的DSS组小鼠体重明显减轻,DAI评分明显升高,结肠壁充血水肿,长度明显缩短;结肠组织病理提示大量炎症细胞浸润,黏膜上皮形成浅溃疡,病理评分明显升高(WT小鼠:13.5±1.06 vs 3.25±0.46,P0.05;Tg小鼠:16.25±1.03 vs 3.38±0.51,P0.05);MPO活性明显升高(P0.05)。与WT小鼠DSS组相比,Tg小鼠DSS组结肠炎症明显增加(P0.05)。给予AS-Ⅳ治疗后,与DSS组相比,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose组和AS-Ⅳhigh dose组小鼠体重明显回升,DAI评分明显下降,结肠肠壁充血水肿不明显,长度缩短不明显;病理评分明显降低(WT小鼠:8.75±0.88 vs 13.5±1.06,P0.05;6±1.06 vs 13.5±1.06,P0.05;Tg小鼠:11.38±1.06 vs 16.25±1.03,P0.05;9.12±0.83 vs 16.25±1.03,P0.05);MPO活性明显降低(P0.05)。AS-Ⅳhigh dose组小鼠治疗效果更佳,与AS-Ⅳlow dose组相比结肠炎症明显降低(P0.05)。与Tg小鼠相比,WT小鼠治疗效果更佳,结肠炎症明显降低(P0.05)。(3)Western blot和real-time Q-PCR检测结肠组织中TL1A和IL-9蛋白及m RNA的表达水平,结果显示:与control组相比,WT和Tg小鼠的DSS组小鼠上述蛋白及m RNA水平明显升高,WT小鼠(TL1A m RNA:0.58±0.038 vs 0.01±0.02,P0.05;TL1A蛋白0.47±0.03 vs 0.15±0.05,P0.05;IL-9 m RNA:0.13±0.009 vs0.01±0.002,P0.05;IL-9蛋白0.44±0.02 vs 0.10±0.02,P0.05);Tg小鼠(TL1A m RNA:1.5±0.05 vs 0.26±0.045,P0.05;TL1A蛋白0.74±0.02 vs0.33±0.04,P0.05;IL-9 m RNA:0.16±0.011 vs 0.02±0.005,P0.05;IL-9蛋白0.73±0.02 vs 0.30±0.02,P0.05)。并且Tg小鼠较WT小鼠升高显著(P0.05)。给予AS-Ⅳ治疗后,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose组和AS-Ⅳhigh dose组TL1A和IL-9蛋白及m RNA的表达水平明显降低(P0.05),DR3蛋白及m RNA表达水平下降不明显,差异无统计学意义(P0.05)。与AS-Ⅳlow dose组相比,WT小鼠AS-Ⅳhigh dose组IL-9蛋白及m RNA水平下降更明显(P0.05),TL1A变化不明显,差异无统计学意义(P0.05)。与AS-Ⅳlow dose组相比,Tg小鼠AS-Ⅳhigh dose组TL1A、IL-9蛋白及m RNA的表达水平均下降更明显(P0.05)。与Tg小鼠相比,WT小鼠治疗效果更佳,TL1A和IL-9蛋白及m RNA的表达水平明显降低(P0.05)。(4)与control组相比,WT和Tg小鼠的DSS组小鼠LPMC、MLN中及脾脏中单个核淋巴细胞的数目明显增加(P0.05),且Tg小鼠较WT小鼠增加显著(P0.05)。给予AS-Ⅳ治疗后,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose组和AS-Ⅳhigh dose组上述细胞数目明显下降(P0.05)。且与AS-Ⅳlow dose组相比,AS-Ⅳhigh dose组的上述细胞数目下降更明显(P0.05)。与Tg小鼠相比,WT小鼠治疗效果更佳,上述细胞数目下降更明显(P0.05)。(5)与control组相比,WT和Tg小鼠的DSS组小鼠MLN中及脾脏中单个核淋巴细胞所包含的Th9细胞的比例明显增加,WT小鼠(MLN中单个核淋巴细胞Th9比例:3.64%±0.22%vs 1.75%±0.021%,P0.05;脾脏中单个核淋巴细胞Th9比例:5.84%±0.1%vs 3.38%±0.29%,P0.05);Tg小鼠(MLN中单个核淋巴细胞Th9比例:9.63%±0.28%vs 1.64%±0.13%,P0.05;脾脏中单个核淋巴细胞Th9比例:9.53%±0.27%vs 2.36%±0.21%,P0.05)。并且Tg小鼠较WT小鼠增加显著(P0.05)。给予AS-Ⅳ治疗后,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose组和AS-Ⅳhigh dose组上述细胞比例明显下降(P0.05)。且与AS-Ⅳlow dose组相比,AS-Ⅳhigh dose组的上述细胞比例下降更明显(P0.05)。与Tg小鼠相比,WT小鼠治疗效果更佳,上述细胞比例下降更明显(P0.05)。(6)ELISA检测LPMC、MLN和脾脏中的单个核细胞上清液以及血清中的IL-9水平显示:与control组相比,WT和Tg小鼠的DSS组小鼠LPMC、MLN和脾脏中单个核淋巴细胞上清液以及血清中的IL-9水平明显升高,WT小鼠(LPMC分泌的IL-9水平:246.16 pg/m L±6.14 pg/m L vs 26.16 pg/m L±2.48 pg/m L,P0.05);Tg小鼠(LPMC分泌的IL-9水平:285 pg/m L±6.78 pg/m L vs 30.16 pg/m L±3.65pg/m L,P0.05)。并且Tg小鼠较WT小鼠升高显著(P0.05)。给予AS-Ⅳ治疗后,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose组和AS-Ⅳhigh dose组IL-9水平明显下降(P0.05)。且与AS-Ⅳlow dose组相比,AS-Ⅳhigh dose组的IL-9水平下降更明显(P0.05)。与Tg小鼠相比,WT小鼠治疗效果更佳,IL-9水平下降更明显(P0.05)。结论:TL1A能够促进Th9细胞分泌IL-9进而导致肠道炎症,而AS-Ⅳ对慢性实验性结肠炎小鼠具有保护作用,并且呈剂量依赖性,可能是通过下调TL1A、抑制IL-9分泌而减轻肠黏膜炎症。


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