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凋亡抑制蛋白家族在莱菔硫烷抑制腺样囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤中作用的实验研究

张耐新  
【摘要】:背景:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是一种恶性肿瘤,主要来源于涎腺上皮。具有如下特点:局部浸润性非常强,极易早期侵犯神经和血管,所以癌细胞容易沿血液扩散到远处。采用手术方法切除肿瘤后,仍然有较高的局部复发率和远处转移率,SACC的肺部转移率远远高于颌面部的其它肿瘤。截止目前,人类在SACC方面的相关研究成果还不能清楚地阐述它的发病及转移机制,所以我们要继续研究SACC的机制,争取从分子和蛋白的层面,搞清楚腺样囊性癌的作用机理,为早日在临床上应用新的抗癌方法或抗癌药物做出贡献。莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是从十字花科蔬菜中提取出来的一种植物性物质,它属于异硫氰酸盐(isothiocyanates,ITCS)类,这种物质有抗癌功效。我们前期关于莱菔硫烷的体外研究成果显示,莱菔硫烷可以提升半胱天冬酶(Caspase)的功能,加速了肿瘤细胞的凋亡,从而抑制了腺样囊性癌细胞系ACC-M,在这个过程中,Bcl-2家族成员也起到了重要作用。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)主要功能是调节细胞凋亡,可以通过抑制Caspase来抑制细胞凋亡,还能参与细胞周期与细胞分裂的调节等。其家族成员共有八位,分别是c-IAP1、c-IAP2、Survivin、Livin、X-IAP、NAIP、Bruce、ILP-2。c-IAP1、c-IAP2、X-IAP能够直接抑制Caspase-3、-7、-9,而Survivin不但能够抑制Caspase-3、-7,还能增强X-IAP等其它IAP家族成员的抗凋亡作用。Livin的作用是降低Caspase-3、-7、-9的活性,ILP-2可以调节Bcl-2的表达,并且使其升高,降低Caspase-9的活性,达到抑制细胞凋亡的目的。NAIP的研究主要集中在神经系统,Bruce可抑制Caspase-9及Smac的活性。在莱菔硫烷抑制腺样囊性癌细胞系ACC-M的增殖过程中,凋亡抑制蛋白家族成员是不是起到一定的作用,在经过SFN处理的人腺样囊性癌裸鼠移植瘤组织中,凋亡抑制蛋白是否表达异常?以往的研究成果尚不能合理的解释这一问题。目的:观察移植瘤被莱菔硫烷抑制的过程中,IAP家族成员的作用如何,是否受到抑制,家族中各个成员的表现是否一致,有没有其它蛋白分子干扰IAP蛋白的作用,研究其可能的分子作用机制,为日后临床应用莱菔硫烷抗癌提供理论依据。方法:1材料1.1人涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-M购自上海交大颌面外科实验室,该细胞株建于1995年。1.2莱菔硫烷(SFN)购自美国LKT实验室,纯度≥99%。1.3裸鼠自北京军事医学科学院购买,雄性10只,4~6周龄,体重为16~20克。1.4抗体从英国Abcam公司购买的X-IAP多克隆抗体,c-IAP2多克隆抗体,c-IAP1多克隆抗体,Livin多克隆抗体,从美国AR公司购买Survivin多克隆抗体,自无锡傲锐东源生物科技有限公司购买二抗酶标羊抗小鼠/兔Ig G聚合物。2实验方法2.1细胞培养将冻存的人涎腺腺样囊性癌细胞复苏,然后在37度恒温培养箱中培养。细胞密度达到要求时,开始传代,最后收集细胞悬液。2.2移植瘤的建立碘酊消毒裸鼠的左前背部以及右后背部,然后将细胞悬液分别注射于上述部位,经口腔给药,实验组予以莱菔硫烷(6 mmol SFN/0.1ml PBS)口服,而对照组口服等量的PBS,每周分三次给药。2.3解剖瘤体三周以后开始将裸鼠处死,然后解剖瘤体,清除掉瘤体表面的血管、坏死组织。然后用石蜡包埋肿瘤组织块,蜡块准备完毕后行免疫组化实验。2.4免疫组化本实验采用免疫组化的方法,观察IAP家族成员中c-IAP1、c-IAP2、Survivin、Livin、XIAP五种蛋白在裸鼠移植瘤组织中的表达情况,并统计染色阳性细胞数目。2.5数据的统计处理本研究有实验、对照两个组,每组10个样本,统计每个样本的随机5个视野阳性细胞总数,用t检验的方法进行分析,最后得出结论。结果:1实验组中,五个视野中c-IAP1阳性细胞总数为1027.2±107.88个,与对照组的1210.6±108.31个相比,阳性细胞数明显减少,有统计学差异(P0.05);2实验组中,五个视野中c-IAP2阳性细胞总数为995.4±113.35个,与对照组的1140.30±122.35个相比,阳性细胞数减少明显,有统计学差异(P0.05);3实验组中,五个视野中Livin阳性细胞总数为1038±156.10个,与对照组的1163.5±85.21个相比,阳性细胞数减少明显,有统计学差异(P0.05);4实验组中,五个视野中Survivin阳性细胞总数为547.80±189.77个,与对照组的959.30±179.77个相比,阳性细胞数减少非常明显,有统计学差异(P0.01);5实验组中,五个视野中X-IAP阳性细胞总数为1072±86.95个,与对照组的1183.2±127.49个相比,阳性细胞数减少明显,有统计学差异(P0.05)。结论:口服莱菔硫烷能够使人涎腺腺样囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤中IAP家族成员c-IAP1、c-IAP2、Survivin、Livin、XIAP的表达明显受到抑制。提示IAP家族成员在莱菔硫烷诱导人涎腺腺样囊性癌ACC-M移植瘤细胞凋亡的过程中起重要作用,这可能是莱菔硫烷诱导腺样囊性癌凋亡的机制之一。


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