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丁苯酞对糖尿病db/db小鼠认知功能障碍及胆碱能系统和细胞凋亡的影响

孔梦佳  
【摘要】:目的:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)会导致认知功能下降,以学习、记忆能力减退为主要特征,甚至可发展为痴呆。海马是参与学习、记忆的重要结构。研究表明海马中胆碱能系统功能受损与神经元细胞凋亡参与认知功能障碍的发生。胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,Ch AT)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ACh E)维持脑内胆碱能神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)动态平衡,其活性是评价大脑皮质和海马功能的标志。在细胞凋亡中,Caspase-3是最关键的凋亡执行者,Bcl-2是公认的凋亡抑制基因。丁苯酞(L-3-n-butylphthalide,NBP)可改善认知功能障碍,但国内外关于丁苯酞对糖尿病相关的认知功能障碍的影响研究甚少。本研究预防性应用丁苯酞,观察丁苯酞对糖尿病db/db小鼠海马神经元组织Ch AT、ACh E、Caspase-3、Bcl-2表达的影响,并探索糖尿病认知功能障碍的可能发病机制。方法:1实验动物分组实验动物共24只,其中8只6周龄健康雄性db/m小鼠,作为正常对照组(NC,n=8只),余下的16只6周龄健康雄性小鼠为糖尿病db/db小鼠,将其随机分为糖尿病对照组(DM-C,n=8只),丁苯酞干预组(DM-NBP,n=8只)。2药物干预适应性喂养1周后,DM-NBP组小鼠给予溶于植物油的丁苯酞(120mg/kg/d)灌胃,NC组及DM-C组小鼠给予等量的植物油灌胃,共进行6周。3一般观察观察小鼠的精神状态、毛色、进食情况、摄水量及尿量变化情况,每周记录小鼠体重及血糖变化。4行为学检测药物干预6周后,实验动物进行水迷宫测试,评价各组小鼠空间学习、记忆能力,连续5天进行定位航行实验,记录小鼠的逃避潜伏期,于第6天进行空间探索实验,记录小鼠穿越平台的次数。5 ELISA法、Real Time PCR、Western Blot检测空间探索实验结束后,将小鼠处死,取其海马组织,应用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测Ch AT和ACh E含量。应用荧光定量-聚合酶链反应(Real Time Polymerase chain reaction,Real Time PCR)及蛋白免疫印迹反应(Western-Blot,WB)分别检测海马组织Caspase-3、Bcl-2 m RNA及蛋白表达水平。6统计学方法实验数据应用SPSS 21.0统计软件进行分析,统计结果以均数±标准差((?)±s)表示,应用重复测量方差分析和完全随机设计的单因素方差分析进行数据分析,两两比较应用S-N-K检验,P0.05为差异有统计学意义。结果:1一般情况观察(体重:g血糖:mmol/L)DM-C组和DM-NBP组小鼠毛发稀疏无光泽,反应迟钝,出现明显的多尿、多饮、多食症状。NC组小鼠一般情况良好,无上述多尿、多饮、多食症状。药物干预6周后,与NC组比较,DM-C组和DM-NBP组小鼠体重、血糖明显升高,差异有统计学意义(体重:58.06±2.38,57.34±2.17 vs 26.39±1.66;血糖:20.94±1.71,20.03±1.66 vs 7.21±0.91,P0.05),DM-C组和DM-NBP组小鼠体重和血糖无明显差异(体重:58.06±2.38 vs 57.34±2.17;血糖:20.94±1.71 vs 20.03±1.66,P0.05)(Table1)。2行为学测试结果2.1基础游泳速度测定结果(cm/s)首先在进行定位航行和空间探索实验前,测定各组小鼠的基础游泳速度,为此将小鼠放入泳池中自由游泳60秒,记录游泳速度,结果显示NC组、DM-C组和DM-NBP组小鼠基础游泳速度无明显差异(138.33±7.40 vs134.70±8.28 vs 136.64±7.14,P0.05)(Fig.1,Table 2)。2.2定位航行实验结果(s)定位航行实验第1天,各组小鼠逃避潜伏期无明显差异(58.06±1.82 vs56.57±2.85 vs 58.11±1.57,P0.05)。第2-5天,DM-C组小鼠逃避潜伏期较NC组明显延长(P0.05)(Fig.1,Table 3),而经丁苯酞干预的DM-NBP组与未经干预的DM-C组比较,小鼠的逃避潜伏期显著缩短,但仍较正常对照组延长,差异有统计学意义(P0.05)(Fig.2,Table 3)。2.3空间探索实验结果(次/60s)在空间探索实验中,DM-C组小鼠穿越平台次数明显少于NC组(P0.05)。然而,丁苯酞干预的DM-NBP组小鼠与未经干预的DM-C组比较显著增加了穿越平台次数,但仍少于NC组,差异有统计学意义(P0.05)(Fig.3,Table 4)。三组小鼠穿越平台次数依次为:NC组DM-NBP组DM-C组,差异有统计学意义(7.00±0.76 vs 5.13±0.64 vs 2.38±0.52,P0.05)。3小鼠海马组织中Ch AT和ACh E的变化(pg/ml)DM-C组小鼠海马组织中Ch AT含量明显低于NC组(32.24±4.28 vs104.21±4.50,P0.05);然而,经丁苯酞干预6周的DM-NBP组小鼠,与未干预的DM-C组比较,海马组织Ch AT含量显著增加,差异有统计学意义(49.88±6.05 vs 32.24±4.28,P0.05)(Fig.4,Table 5)。与Ch AT结果相反,DM-C组小鼠海马组织ACh E含量明显高于NC组(108.92±5.64 vs 58.64±6.71,P0.05);有意义的是丁苯酞干预避免了ACh E的升高,导致DM-NBP组小鼠海马组织ACh E含量显著低于DM-C组,差异有统计学意义(83.70±4.95 vs 108.92±5.64,P0.05)(Fig.5,Table6)。4细胞凋亡相关指标的变化DM-C组小鼠海马组织中Caspase-3 m RNA和蛋白的表达明显高于NC组(P0.05);经丁苯酞干预6周的DM-NBP组小鼠,与未经干预的DM-C组比较,小鼠海马组织中Caspase-3 m RNA和蛋白的表达明显降低,但仍高于NC组,差异有统计学意义(P0.05)(Fig.6,Fig.8,Fig.10,Table7,Table 9)。与Caspase-3结果相反,DM-C组小鼠海马组织中Bcl-2 m RNA和蛋白表达明显低于NC组;经丁苯酞干预的DM-NBP组小鼠,与未经干预的DM-C组比较,小鼠海马组织中Bcl-2 m RNA和蛋白的表达显著增加,但仍低于NC组,差异有统计学意义(P0.05)(Fig.7,Fig.9,Fig.10,Table8,Table 10)。结论:1糖尿病db/db小鼠13周龄时学习、记忆能力明显下降。2糖尿病db/db小鼠海马组织中ACh E、Caspase-3表达显著升高,Ch AT、Bcl-2表达显著下降,提示胆碱能系统受损、神经元细胞凋亡可能是糖尿病认知功能障碍的发病机制。3丁苯酞可以改善糖尿病db/db小鼠认知功能障碍,降低ACh E、Caspase-3的表达,上调Ch AT、Bcl-2的表达。推测丁苯酞是通过降低胆碱能系统功能损伤、减少神经元细胞凋亡,从而抑制糖尿病认知功能障碍的发生。


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