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Ang-(1-7)及其受体Mas对大鼠卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗的影响

王慧颖  
【摘要】:目的:体外培养新鲜原代大鼠卵巢颗粒细胞,构建大鼠卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗模型,外源性添加血管紧张素II(AngⅡ)、血管紧张素1-7(Ang-(1-7))、血管紧张素1-7受体Mas的激动剂和拮抗剂,通过检测各组培养基中葡萄糖剩余量及乳酸堆积量,观察胰岛素抵抗的变化情况,以及Ang-(1-7)是否能通过其受体Mas改善局部卵巢颗粒细胞的胰岛素抵抗。方法:1构建大鼠卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗模型购买新鲜原代大鼠卵巢颗粒细胞,体外培养传代,加入地塞米松、胰岛素培养4天后,氧化酶-过氧化物酶法测定培养基中剩余葡萄糖含量,比色法测定乳酸堆积量,与空白对照组进行比较,确认胰岛素抵抗模型构建完成;2将大鼠卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗模型分为3组,第1组空白模型对照,第2组加入AngⅡ(10~(–6)mol/L)、第3组加入Ang-(1-7)(10~(-5)mol/L),培养24小时后,氧化酶-过氧化物酶法测定培养基中剩余葡萄糖含量,比色法测定乳酸堆积量,通过比较各组葡萄糖及乳酸含量的变化差值(差值越小说明葡萄糖消耗少,乳酸产生少,胰岛素抵抗越严重),观察AngⅡ、Ang-(1-7)对卵巢局部胰岛素抵抗的影响;3将大鼠卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗模型分为4组,第1组空白模型对照,第2组加入Ang-(1-7)(10~(-5)mol/L)、第3组加入AVE0991(血管紧张素1-7受体Mas的激动剂)(10~(-5)mol/L)、第4组加入Ang-(1-7)+A799(血管紧张素1-7受体Mas的拮抗剂)(10~(-5)mol/L),培养24小时后,氧化酶-过氧化物酶法测定培养基中剩余葡萄糖含量,比色法测定乳酸堆积量,计算比较各组葡萄糖及乳酸的含量变化,与空白模型对照组及Ang-(1-7)组相比较,了解Ang-(1-7)是否是通过与其受体Mas结合对卵巢局部胰岛素抵抗产生影响。结果:1大鼠卵巢颗粒细胞体外生长情况:本实验购买的大鼠卵巢颗粒细胞采用机械分离法制备,细胞成活率可达90%以上。颗粒细胞体外培养速度缓慢,倒置显微镜下观察,细胞培养24h后开始呈单层贴壁生长、增殖,呈梭形或多边形,培养48h后细胞明显增殖,2-5d处于增殖高峰,7-9d细胞开始出现退化现象,漂浮细胞逐渐增多。2地塞米松+胰岛素诱导大鼠卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗模型:将新鲜原代大鼠卵巢颗粒细胞培养传代后分为两组,实验组在地塞米松和胰岛素共同作用4d后,测得对照组和实验组培养基中剩余葡萄糖含量分别为:7.4888±0.6624、10.4969±0.7812,乳酸堆积量分别为:23.7339±0.8934、13.0538±0.8869,培养基中剩余葡萄糖含量实验组明显高于空白对照组,乳酸堆积量低于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05)。3加入AngⅡ(10~(–6)mol/L)作用于大鼠卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗模型24h后,测得AngⅡ及空白模型对照组培养基中葡萄糖含量变化差值分别为:1.9856±0.3051、3.4987±0.7036,乳酸堆积量变化差值分别为:14.2944±0.7196、20.7581±1.4459,培养基中葡萄糖含量及乳酸堆积量变化差值均低于空白模型对照组,且差异有统计学意义(P0.05);Ang-(1-7)(10~(-5)mol/L)作用于大鼠卵巢颗粒细胞24h后,测得培养基中葡萄糖含量变化差值为:7.4698±1.0264,乳酸堆积量变化差值为:30.3427±2.6144,培养基中葡萄糖含量及乳酸堆积量变化差值均高于空白模型对照组及AngⅡ组,且差异有统计学意义(P0.05)。4 Ang-(1-7)受体Mas激动剂AVE0991(10~(-5)mol/L)作用于大鼠颗粒细胞24h后,测得AVE0991组、Ang-(1-7)组、空白模型对照组培养基中葡萄糖含量变化差值分别为:3.5345±0.8142、7.4698±1.0264、3.4987±0.7036,乳酸堆积量变化差值分别为:20.1532±1.8087、30.3427±2.6144、20.7581±1.4459,培养基中葡萄糖含量及乳酸堆积量变化差值与空白模型对照组相比无明显差异(P0.05),与Ang-(1-7)组相比,培养基中葡萄糖含量及乳酸堆积量变化差值均明显低于Ang-(1-7)组,差异有统计学意义(P0.05);Ang-(1-7)+受体Mas拮抗剂A799(10~(-5)mol/L)作用于大鼠卵巢颗粒细胞24h后,测得Ang-(1-7)+A799组及Ang-(1-7)组培养基中葡萄糖含量变化差值分别为:6.1481±0.6186、7.4698±1.0264,乳酸堆积量变化差值分别为:25.4194±2.1254、30.3427±2.6144,培养基中葡萄糖含量及乳酸堆积量变化差值均明显低于Ang-(1-7)组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1地塞米松+胰岛素能够诱导大鼠卵巢颗粒细胞的胰岛素抵抗模型,细胞对葡萄糖的摄取减少,产生的乳酸堆积量也减少;2 AngⅡ能够加重卵巢局部的胰岛素抵抗,Ang-(1-7)能够缓解卵巢局部的胰岛素抵抗;3 Ang-(1-7)+Mas受体拮抗剂A799作用于细胞胰岛素抵抗模型后,能够显著降低Ang-(1-7)对卵巢局部胰岛素抵抗的改善作用,提示Ang-(1-7)可能是通过与其受体Mas结合后起作用的;但是Mas受体激动剂AVE0991作用于细胞胰岛素抵抗模型后,对大鼠卵巢局部胰岛素抵抗无明显改善作用,其中的原因还需要进一步的探究。


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