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特定发育阶段胚肝细胞诱导肝癌细胞HepG2分化的作用及机制

肖志刚  
【摘要】:目的:肿瘤死亡率已跃居人类疾病死亡原因的第二位。中国年均约55万人死于肝癌,是世界平均死亡率的2.21倍。肝癌中最重要类型是肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinogenesis,HCC),约占原发性肝癌的90%。但目前缺乏针对HCC的特效治疗方案,传统手术、放、化治疗复发率高、毒副作用大,病人生存质量极差。因此应重新认识肿瘤发生和久治不愈的原因,寻找有效治愈肿瘤的新思路新方法。研究证实,胚胎干细胞与肿瘤细胞具有很多共有特征:可塑性、免疫逃逸、永生化,均表达胚胎特征性蛋白。近年来,一系列基础和临床的研究显示,肿瘤细胞起源于增值和分化异常的组织来源干细胞。大量研究发现,胚胎干细胞微环境可抑制肿瘤的侵袭行为,并逆转其恶性表型。据此导师齐锦生教授认为,肿瘤细胞为停滞于某分化阶段,而呈无限增殖的“正常干细胞”或细胞的“返祖”现象。并进一步提出,用特定发育阶段的胚胎细胞可诱导相同组织来源的肿瘤细胞分化(同源同步诱导分化),从而达到治疗肿瘤的目的。前期实验选用不同发育阶段的胚肝细胞与肝癌细胞HepG2共培养,已初步证实胚肝细胞可通过重建肝细胞核因子HNF-4α调控环路,诱导肝癌细胞HepG2分化。前期研究表明,胚肝细胞诱导肝癌细胞HepG2分化无种属差异性,并以非接触式的通讯方式起作用。因此,引起诱导分化作用的信号通路应当是高度保守、外分泌性的。Wnt/β-catenin信号通路是一个跨物种的高度保守的信号通路,与发育、分化、增殖等密切相关。Wnt信号作为关键调节分子,以自分泌/旁分泌形式来发挥作用。在肝脏的发育过程和功能维持以及体外诱导干细胞向肝细胞的分化过程中,Wnt/β-catenin信号通路起着关键作用。那么,胎肝细胞是否通过调整Wnt/β-catenin通路,激活HNF-4α基因表达,从而诱导HCC细胞分化呢?无相关文献报道。本研究旨在重新认识肿瘤发生本质基础上,以肝癌为研究对象,分离纯化鉴定胚肝细胞,证实特定发育阶段胚肝细胞诱导肝癌细胞HepG2分化作用,验证“同源同步诱导分化”理论,并进一步探究诱导分化过程中的相关信号通路及分子机制,为治疗HCC提供实验依据为,肿瘤治疗提供新的思路和方法。方法:1.特定发育阶段小鼠胚肝细胞的分离纯化及鉴定在课题组前期实验研究的基础上,选用发育13.5 d(E13.5 d)胎鼠进行实验。采用Ⅳ胶原酶消化法,消化小鼠胚肝组织,分离为单个胚肝细胞;多次重复差速贴壁法除去成纤维细胞,纯化胚肝细胞。HE染色法观察胎肝组织形态,免疫组化法检测胎肝特定发育阶段蛋白AFP、CK19表达情况,流式细胞术检测胎肝细胞中干细胞标记物CD90.1和CD133阳性表达率,免疫荧光法检测胚肝细胞AFP表达情况。2.细胞培养胚肝细胞用高糖DMEM培养;HepG2细胞用含1%非必需氨基酸和10%新生牛血清的DMEM高糖培养基培养,0.25%的胰蛋白酶消化传代,接种于100mL培养瓶中,在37℃、5%CO2培养箱中培养。3.模型建立及分组利用六孔板的“Transwell”小室建立HepG2细胞与胚肝细胞的非接触式共培养体系。HepG2细胞与发育13.5 d的胚肝细胞共培养,HepG2细胞培养于在Transwell孔的下部,胚肝细胞培养于在Transwell的膜上部。探究E13.5 d的胚肝细胞诱导HepG2细胞分化作用,分为四组:untreated组(HepG2细胞单独培养);co-culture24 h组(HepG2细胞与E13.5d的胚肝细胞共培养24 h);co-culture48 h组;co-culture72 h组。探究诱导HepG2细胞分化过程中Wnt/β-catenin通路的作用,共培养体系中加入β-catenin抑制剂(XAV-939),实验分为四组:单纯HepG2细胞组(对照组)、共培养组、单纯β-catenin抑制剂组、共培养组+β-catenin抑制剂组,共培养48 h。4.HepG2细胞与胚肝细胞共培养后,HepG2细胞状态观察及检测相差显微镜下观察并照相记录,不同处理组中HepG2细胞的形态变化;流式细胞术检测诱导后HepG2细胞凋亡情况;免疫荧光法检测,共培养后HepG2细胞中AFP的表达量。5.HepG2细胞与胚肝细胞共培养后,HepG2细胞中HCC标志基因afp、c-myc,肝细胞分化调控基因的hnf-4α,肝细胞成熟标志基因cyp1b1、adh1c转录水平的检测Trizol一步法分别提取HepG2细胞中总RNA;用β-actin做内参,Real-time PCR方法检测afp、c-myc、cyp1b1、adh1c和hnf-4α的mRNA表达。6.HepG2细胞与胚肝细胞共培养后,HepG2细胞中AFP、HNF-4α、β-catenin蛋白含量的检测收集HepG2细胞,RIPA裂解法提取总蛋白后,考马斯亮蓝法测定蛋白含量,Western-blotting检测HepG2细胞中AFP、HNF-4α、β-catenin蛋白含量。7.HepG2细胞与胚肝细胞共培养后,HepG2细胞中β-catenin蛋白核转位,及HNF-4α蛋白表达情况的检测收集HepG2细胞,两步裂解法提取核蛋白和胞浆蛋白,考马斯亮蓝法测定蛋白含量,Western-blotting检测β-catenin蛋白、HNF-4α蛋白在HepG2细胞核和细胞浆中表达情况;免疫荧光检测β-catenin蛋白、HNF-4α蛋白在HepG2细胞核和细胞浆分布情况。结果:1.特定发育阶段小鼠胚肝细胞的分离纯化及鉴定选用E13.5 d小鼠胎鼠进行取材,采用Ⅳ胶原酶消化法,成功分离为单个胚肝细胞;多次重复差速贴壁法纯化胚肝细胞;高糖DMEM正常培养胚肝细胞,相差显微镜下胚肝细胞为圆形、透亮、有立体感,且成活率高、存活时间长;采用免疫组化法检测到胎肝组织中AFP、CK19阳性表达,流式细胞术检测胎肝细胞中CD90.1+和CD133+表达率分别为70.8%和60.8%,利用免疫荧光法检测到胚肝细胞特定发育阶段蛋白AFP,提示E13.5 d小鼠胚肝细胞分离纯化成功,并具备干细胞特性。2.特定发育阶段小鼠胚肝细胞诱导肝癌细胞HepG2分化2.1 HepG2细胞与胚肝细胞共培养后,HepG2细胞状态观察及检测本实验利用六孔板的“Transwell”小室建立了HepG2细胞与胚肝细胞的非接触式共培养体系。相差显微镜观察HepG2细胞形态变化,与正常组相比(HepG2细胞生长旺盛、叠加生长、密度大、形态呈多角形或梭型、胞浆透亮、多个细胞核且形状不规则),共培养后HepG2细胞生长明显抑制、形态趋于正常肝细胞样的六边形、多为单核,一部分细胞回缩、变圆、透亮度下降,脱落悬浮,最终崩解。流式细胞术检测到,同正常组相比,共培养后HepG2细胞发生早期凋亡和坏死。免疫荧光法检测HepG2细胞中AFP的表达情况,与正常组比,共培养48 h后,Hep G2细胞中AFP的表达显著降低。2.2 HepG2细胞与胚肝细胞共培养后,HepG2细胞中afp、c-myc、cyp1b1、adh1c和hnf-4α基因转录水平的变化HepG2细胞与E13.5 d胚肝细胞共培养后,与con组比,HepG2细胞中AFP、c-Myc mRNA的相对表达量,24 h组、48 h组均显著降低;HNF-4αmRNA的相对表达量,24 h组、48 h组均显著升高;CYP1B1、ADH1C mRNA的相对表达量,24 h组无显著差异,48 h组均显著升高。共培养后,HepG2细胞癌性基因表达减少,分化基因表达增加,共培养48 h后,HepG2细胞成熟基因表达增加。HepG2细胞与胚肝细胞共培养72 h后,大量细胞死亡脱落,未检测。2.3 HepG2细胞与E13.5 d胚肝细胞共培养48 h后,HepG2细胞中AFP、HNF-4α、β-catenin蛋白含量的变化HepG2细胞与E13.5 d胚肝细胞共培养48 h后,正常组相比,HepG2细胞中AFP蛋白含量,共培养组、抑制剂组、共培养+抑制剂组均显著降低;HepG2细胞中HNF-4α蛋白含量,共培养组均显著升高,抑制剂组、共培养+抑制剂组无显著差异;HepG2细胞中β-catenin蛋白含量,共培养组,抑制剂组、共培养+抑制剂组均显著降低。抑制β-catenin表达,共培养过程后,HNF-4α蛋白表达无明显变化,影响诱导分化效果。免疫荧光检测HepG2细胞中AFP、HNF-4α、β-catenin蛋白表达变化情况同Western-blotting检测结果一致。3.E13.5胚肝细胞通过调整Wnt/β-catenin通路诱导肝癌细胞HepG2分化Western-blotting和免疫荧光法检测到,HepG2细胞与E13.5 d胚肝细胞共培养48 h后,HepG2细胞中β-catenin发生了核转位,HepG2细胞核中HNF-4α蛋白表达显著升高。加入β-catenin抑制剂后,β-catenin表达显著降低,HNF-4α蛋白表达无明显变化,表明HNF-4α蛋白表达升高与β-catenin发生核转位具有相关性。结论:1.特定发育阶段小鼠胚肝细胞分离纯化培养成功,经鉴定具备干细胞特性。2.特定发育阶段小鼠胚肝细胞微环境以非接触方式诱导肝癌细胞株HepG2分化,使其失去无限增殖能力。3.Wnt/β-catenin信号通路参与了小鼠胚肝细胞诱导人肝癌细胞HepG2分化过程,β-catenin发生核转位调控HNF-4α表达,促进了HCC细胞分化。


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