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丁苯酞通过抑制PGAM5介导的坏死性凋亡对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发挥保护作用

王颖  
【摘要】:多发性硬化(MS)是中枢神经系统持久性的自身免疫性炎性、脱髓鞘疾病。多发性硬化的病理特点是白质脱髓鞘、炎症、轴索损伤及血脑屏障的破坏。多发性硬化的病因至今未明,发病机制复杂,可能和病毒感染、遗传背景、环境因素有关。因此,多发性硬化可能不仅单纯是一种疾病,而是综合征,表现为炎性脱髓鞘及多种发病机制。由于多发性硬化的发病机制复杂,近年来,有研究认为,坏死性凋亡参与了多发性硬化的发病机制。调节细胞死亡在机体的生长发育及维持组织动态平衡方面起到重要作用。坏死性凋亡是一种新型的调节坏死的通路,它是一种程序性的细胞死亡。一直以来,人们认为,凋亡是唯一的调节细胞死亡的方式,而坏死是不可调控的,是偶然的死亡方式。近年来大量的证据表明,坏死性凋亡是调节坏死最好的方式之一。我们许多对坏死性凋亡通路的了解源于TNF-α通路,TNF-α和TNFR1结合,然后激活下游的坏死小体RIPK1-RIPK3-MLKL,最后由与线粒体相关的PGAM5-DRP1轴完成坏死性凋亡。丁苯酞是一种人工合成的复合物,源于芹菜籽的提取物。丁苯酞可以保护缺血引起的的脑组织损伤,对神经细胞的死亡起到保护作用,提高脑血流量,保护血脑屏障,除此之外,丁苯酞还有抗炎,抗血栓,抗凋亡,保护线粒体的作用,基于它对线粒体的保护作用,我们认为丁苯酞可能对EAE对治疗有益。多发性硬化的模型不止一种,针对该疾病的研究方向不同,选择不同的疾病模型。实验性自身性免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化最常应用的模型。我们的实验采用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠制备EAE模型,观察丁苯酞干预后,是否对EAE小鼠起到了神经保护作用,沉默坏死性凋亡通路中的PGAM5基因,观察是否保护了EAE小鼠的神经功能。体外实验,培养BV2小胶质细胞,探讨丁苯酞对EAE小鼠发挥神经保护作用的机制,找到该药的潜在治疗靶点。第一部分丁苯酞对实验性自身免疫性脑脊髓炎保护作用及对坏死性凋亡的影响目的:建立最经典的多发性硬化的小鼠模型,利用丁苯酞干预,观察实验小鼠发病后,对药物的反应,应用HE染色、电镜、Western Blot的方法,检测丁苯酞是否对EAE小鼠有神经保护作用及对坏死性凋亡通路中蛋白的影响。方法:1.实验小鼠的选用,建立动物模型。应用C57BL/6雌性小鼠,为8-10周龄,约为18-20g的体重,应用MOG35-55作为免疫原,然后加入等体积的完全弗氏佐剂(CFA)及一定含量的结核菌素相互混,使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠背部皮下注射,并分别于免疫的当天及第2天,分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX),建立EAE小鼠模型。2.将实验小鼠随机分为正常对照组、EAE组及丁苯酞治疗组。自发病后的第一天起,丁苯酞组小鼠每日腹腔注射丁苯酞80mg/kg,正常对照组小鼠及EAE模型组小鼠自发病后的第1天起,每日给予等量的DMSO及生理盐水溶液腹腔注射。3.自免疫后的第1天起,分别由两名实验员分两个时间段采用双盲法于每天早晚(8:00和16:00)两次对小鼠进行神经功能评分并称重。神经功能评分使用的是评分更为详细的Weaver’s(15分)法。4.组织病理学观察用HE染色观察实验小鼠脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况。5.用透射电镜观察,实验小鼠线粒体的变化及髓鞘的变化。6.用Western Blot的方法,检测各组实验小鼠坏死性凋亡通路上蛋白及炎症相关蛋白的表达变化。7.采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”(x±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。多组计量资料均数的比较应用Kruskal-Wallis检验,组间两两比较用LSD检验。以P0.05为差异具有统计学意义。结果:1.丁苯酞干预EAE小鼠,可以缓解EAE小鼠的临床症状,降低EAE小鼠神经功能学评分;2.丁苯酞药物干预EAE小鼠,可以减少中枢神经系统的炎性细胞的浸润;3.丁苯酞药物干预EAE小鼠,通过透射电镜观察,发现丁苯酞可以保护线粒体,减轻脱髓鞘的程度。4.丁苯酞下调了坏死性凋亡通路上蛋白及炎性蛋白的表达:TNFα和TNFR1表达较模型组下调,RIPK1、RIPK3、MLKL表达较模型组下调,PGAM5、DRP1表达较模型组下调,IL-1β的表达较模型组下调。第二部分沉默PGAM5基因表达对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的影响目的:建立EAE的小鼠动物模型,沉默PGAM5基因,观察PGAM5基因沉默组和EAE小鼠模型组,脊髓炎性细胞浸润情况的变化,脊髓中PGAM5,DRP1,p-DRP1蛋白表达的变化,PGAM5,TNFα,IL-1β转录水平的变化,并观察线粒体及髓鞘在这个过程的变化。为沉默PGAM5基因是否能保护EAE小鼠的神经功能提供理论依据。方法:1.实验动物的选用,动物模型的建立。选用清洁级的雌性C57BL/6小鼠作为实验动物,周龄大约为8-10周,体重大约为18-20g,应用MOG35-55作为免疫原,然后加入等体积的完全弗氏佐剂(CFA)及一定含量的结核菌素相互混,使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠背部皮下注射,并分别于免疫的当天及第2天,分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX),建立EAE小鼠模型。2.病理组织学的观察沉默的PGAM5基因,干预EAE小鼠,在疾病的高峰期,取实验小鼠的脊髓腰膨大,用HE染色的方法,观察实验小鼠脊髓腰膨大炎细胞浸润的情况。3.Western Blot检测沉默的PGAM5基因,干预EAE小鼠,取疾病高峰期实验小鼠的脊髓,检测PGAM5、DRP1、p-DRP1蛋白的表达水平的变化。4.qRT-PCR方法检测沉默的PGAM5基因,干预EAE小鼠,取疾病高峰期实验小鼠的脊髓,检测各组PGAM5、TNFα、IL-1βmRNA的转录水平的变化。5.透射电镜观察沉默PGAM5基因,在疾病的高峰期取各组实验小数的脊髓,用透射电镜观察实验小鼠线粒体及髓鞘的变化。6.采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”(x±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。多组计量资料均数的比较应用Kruskal-Wallis检验,组间两两比较用LSD检验。以P0.05为差异具有统计学意义。结果:1.EAE模型组实验小鼠病理组织切片呈现出弥漫性的炎性细胞,EAE+PGAM5 shRNA组炎性细胞明显减少。2.沉默PGAM5基因,用Western blot在脊髓组织中检测到,PGAM5的表达,EAE组较正常对照组表达升高,在沉默组,表达明显低于EAE组,在EAE组小鼠较正常对照组小鼠DRP1表达上调,在沉默组,表达下调。P-DRP1的表达,在EAE组较正常对照组降低,在PGAM5沉默组较EAE组升高。3.用qPCR检测PGAM5、TNFα、IL-1β在转录水平的表达变化,在EAE组中,PGAM5表达较正常组升高,在PGAM5沉默组,PGAM5的表达水平较EAE组降低。TNFα的表达水平在EAE组较正常组上调,在PGAM5沉默组较EAE组表达下调。IL-1βmRNA的转录水平在EAE组较正常组表达升高,在基因沉默组较EAE组表达下调。4.沉默PGAM5基因,EAE小鼠的脱髓鞘程度减轻,线粒体的结构相对完整。第三部分丁苯酞通过调制PGAM5抑制小胶质细胞的坏死性凋亡目的:利用BV2小胶质细胞,制造坏死性凋亡的模型,研究丁苯酞对坏死性凋亡通路中PGAM5-DRP1轴的作用,进一步探讨丁苯酞治疗EAE小鼠的作用机制。方法:1.选取BV2小胶质细胞,将细胞培养于高糖DMEM培养基中,其中含有10%的胎牛血清、100μg/ml的链霉素、100U/ml的青霉素。在恒定湿度的培养箱(温度37℃,含5%CO2)中培养。2.坏死性凋亡的模型建立以及药物、病毒干预。把BV2小胶质细胞分为7组,待细胞长到50%-60%时,在第4组中加入腺病毒携带的沉默的PGAM5基因,第5组中加入第4组的空病毒对照,第6组中加入腺病毒携带的过表达PGAM5基因,第7组中加入过表达空病毒对照,21h,分别于第3、6、7组加入丁苯酞(10uM),24h,同时加入造模药物TNF-α(50ng/ml)及Z-VAD-FMK(50umol/L),建立坏死性凋亡模型,48h,收集7组细胞,进行各项指标的检测。3.用qRT-PCR的方法,检测不同组BV2细胞中,IL-1α和IL-1βmRNA的表达。4.Western Blot检测不同组BV2细胞中,PGAM5、DRP1、p-DRP1的蛋白表达5.采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”(x±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。多组计量资料均数的比较应用Kruskal-Wallis检验,组间两两比较用LSD检验。以P0.05为差异具有统计学意义。结果:1.在模型组中,IL-1αmRNA的转录水平较正常对照组表达上调。模型+shPGAM5组IL-1αmRNA的转录水平较模型组表达下调。模型+shPGAM5空病毒对照组IL-1αmRNA的转录水平较模型组未见明显差异。模型+丁苯酞组IL-1αmRNA的转录水平较模型组明显下调。模型+NBP+过表达PGAM5腺病毒组IL-1αmRNA的转录水平较模型组表达无明显差异。模型+NBP+过表达空病毒对照组IL-1αmRNA的转录水平较模型组表达下调。2.应用PCR方法,检测IL-1β在mRNA的转录水平的变化。在模型组中,IL-1βmRNA转录水平较正常对照组表达上调。模型+shPGAM5组IL-1βmRNA的转录水平较模型组表达下调。模型+shPGAM5空病毒对照组IL-1βmRNA的转录水平较模型组未见明显差异。模型+丁苯酞组的IL-1βmRNA的转录水平较模型组表达下调。模型+NBP+过表达PGAM5腺病毒组IL-1βmRNA的转录水平较模型组表达无明显差异。模型+NBP+过表达空病毒对照组IL-1βmRNA的转录水平较模型组表达下调。3.用Western Blot的方法检测7组细胞PGAM5蛋白表达情况:在模型组中,PGAM5的蛋白表达水平较正常对照组上调。模型+shPGAM5组PGAM5的蛋白表达水平较模型组下调。模型+shPGAM5空病毒对照组较模型组PGAM5的蛋白表达水平较模型组未见明显差异。模型+丁苯酞组PGAM5的蛋白表达水平较模型组下调。模型+NBP+过表达PGAM5腺病毒组PGAM5的蛋白表达水平较模型组表达无明显差异。模型+NBP+过表达空病毒对照组PGAM5的蛋白表达水平较模型组表达下调。4.用Western Blot的方法检测7组细胞DRP1蛋白表达情况:在模型组中,DRP1的蛋白表达水平较正常对照组明显上调。模型+shPGAM5组DRP1的蛋白表达水平较模型组下调。模型+shPGAM5空病毒对照组较模型组DRP1的蛋白表达水平较模型组未见明显差异。模型+丁苯酞组DRP1的蛋白表达水平较模型组下调。模型+NBP+过表达PGAM5腺病毒组DRP1的蛋白表达水平较模型组表达无明显差异。模型+NBP+过表达空病毒对照组DRP1的蛋白表达水平较模型组表达下调。5.用Western Blot的方法检测7组细胞p-DRP1蛋白表达情况:在模型组中,p-DRP1的蛋白表达水平较正常对照组下调。模型+shPGAM5组p-DRP1的蛋白表达水平较模型组上调。模型+shPGAM5空病毒对照组较模型组p-DRP1的蛋白表达水平较模型组未见明显差异。模型+丁苯酞组p-DRP1的蛋白表达水平较模型组上调。模型+NBP+过表达PGAM5腺病毒组p-DRP1的蛋白表达水平较模型组表达无明显差异。模型+NBP+过表达空病毒对照组DRP1的蛋白表达水平较模型组表达上调。结论:1.丁苯酞缓解了EAE小鼠的临床症状,抑制炎症反应,下调TNF-α及IL-1β的表达,对模型小鼠的线粒体具有保护作用。抑制了坏死性凋亡通路上蛋白的表达。2.沉默PGAM5基因,同样对EAE小鼠起到神经保护作用,PGAM5介导的坏死性凋亡参与了多发性硬化/EAE的发病机制。3.在BV2小胶质细胞的体外实验中,丁苯酞通过调制PGAM5抑制IL-1α、IL-1β的表达,抑制小胶质细胞中的坏死性凋亡。证明PGAM5是丁苯酞在多发性硬化/EAE坏死性凋亡发病机制中的作用靶点。


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