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基于钙离子浓度调节、抗氧化应激、抗炎症反应的丹参酸A对心血管保护作用的研究

宋琼涛  
【摘要】:缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)是最为常见、最为严重的心血管疾病之一,随着年龄的增长其发生率和死亡率居高不下。ICM发病机制复杂,其中心肌梗塞(myocardial infarction,MI),动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)和内皮损伤为ICM最常见的病因。MI患者持续缺血,导致心肌缺血,供氧下降,ATP产生减少,心肌能量供应不足,钙泵失效。大量Ca~(2+)向心肌细胞内转移,并伴随着肌浆网Ca~(2+)摄取的显著降低,二者共同作用引发心肌细胞钙超载,并最终成为心肌细胞结构破坏的主要诱导因子,导致心肌细胞线粒体损伤,心肌坏死和心律失常,使原本受损的心脏功能进一步恶化,最终发展成ICM。此外,心肌细胞内Ca~(2+)浓度的升高能够显著增加心肌收缩力,最终导致心肌耗氧量增加,使ICM患者病情恶化。因此,能够调节细胞内钙稳态的药物具有保护ICM的潜力。氧化应激、血管炎症反应与心血管事件发生风险的相关性研究目前较为活跃。氧化应激和炎症反应紧密相联,二者相互作用造成内皮功能障碍。内皮功能障碍反过来又促进了促炎症反应,产生如内皮细胞粘附分子分泌增加以及花生四烯酸代谢产物和趋化分子失衡等现象。而内皮功能障碍已被证实是AS早期进程中的关键因素。因此,具有抗炎、抗氧化和抗内皮损伤作用的药物有望成为ICM治疗的候选药物。在中国传统医学当中,丹参(Radix Salviae Milthiorrhizae)被广泛用于治疗诸如心绞痛、MI、脑卒中、心肌缺血等心血管疾病。丹参酸A(salvianic acid A,SAA)作为一种水溶性的化合物,是丹参主要的药理活性成分。近期的研究表明,丹参水提物注射液(含2.15mg/mL SAA)能够通过抑制L-型钙离子通道(L-type calcium channels,LTCCs)和心肌收缩力发挥心脏保护作用,其作用类似于钙通道阻滞剂。相关实验研究已证实SAA具有降低炎症反应、清除ROS等作用,但其心血管保护机制的研究较为分散和局限。我们推测SAA通过抑制氧化应激、血管炎症、调节细胞内Ca~(2+)浓度发挥其ICM保护作用。本研究论文主要从动物实验和细胞实验等层次多方面探讨SAA对ICM保护作用及其机制,主要包括以下内容:(1)SAA对大鼠急性心肌梗塞的保护作用及机制研究;(2)SAA对大鼠动脉粥样硬化的保护作用及机制研究;(3)SAA对内皮细胞损伤的保护作用及机制研究。论文具体内容如下:第一部分SAA对大鼠急性心肌梗塞的保护作用及机制研究目的:本研究主要探讨SAA对异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导大鼠MI的保护作用,并基于SAA对心肌细胞内钙稳态的调节能力阐明其潜在的心肌保护机制。方法:所有SD大鼠随机分组如下(n=8):空白对照组(Con)、异丙肾上腺素模型组(ISO)、低剂量SAA治疗组(3 mg/kg/d,L-SAA)、高剂量SAA治疗组(10 mg/kg/d,H-SAA)和维拉帕米阳性药对照组(2 mg/kg/d,Ver)。Con和ISO组给予相同体积生理盐水。所有治疗均采用腹腔注射(i.p.)给药。经过连续7天的预处理后,随后连续2天皮下注射(s.c.)ISO(85mg/kg/d,Con组除外)。采用IonOptix细胞动缘探测和细胞内离子成像系统及全细胞膜片钳技术检测SAA对心肌细胞内钙稳态的调节作用。结果:1.SAA显著降低ISO诱导的MI大鼠ST段抬升和心率;2.SAA显著改善ISO诱导的MI大鼠心肌细胞肿胀、变性和横纹丧失等病理症状;3.SAA显著降低ISO诱导的MI大鼠血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的水平;4.Ion Optix记录显示心室肌细胞与fura-2-AM共同孵育,SAA(3×10~(-7)M)可以显著抑制大鼠心室肌细胞钙瞬变的峰值,其抑制率为50.64±1.33%;5.SAA在3×10~(-7) M可显著延长心室肌细胞收缩达10%峰值的时间(Tp),同时显著缩短心室肌细胞舒张达10%基线的时间(Tr);6.Ion Optix记录显示SAA(3×10~(-7) M)可显著抑制大鼠心室肌细胞收缩幅度,其抑制率为33.48±0.75%;7.全细胞膜片钳记录显示SAA(3×10~(-6),10~(-5),3×10~(-5),10~(-4),3×10~(-4) M)对I_(Ca-L)抑制率分别为9.5±0.9%,17.6±1.1%,29.6±1.8%,34.6±1.9%,39.5±1.9%,其IC_(50)为1.47±10~(-5) M;8.SAA(3×10~(-6),3×10~(-4) M)可在激活电位和峰电位保持不变的情况下显著上移I-V关系曲线。第二部分SAA对大鼠动脉粥样硬化的保护作用及机制研究目的:本研究的主要目的是探讨SAA对高脂饮食诱导的AS的影响并基于氧化应激和炎症反应阐明其分子机制。方法:采用复合方法即高脂饮食(正常饲料包含40%脂肪(饱和脂肪油)和5%胆固醇)6周加单次腹腔注射(i.p.)Vitamin D3(600000 IU/kg)复制AS大鼠模型。SD大鼠随机分组如下(n=10):空白对照组(Con)、AS大鼠模型组(AS)、低剂量SAA治疗组(3 mg/kg/d,L-SAA)、高剂量SAA治疗组(10 mg/kg/d,H-SAA)和辛伐他汀阳性药对照组(5 mg/kg/d,Sim)。除Con组外,其余各组均采用复合方法制作AS大鼠模型。L-SAA,H-SAA和Sim组分别给予对应药物并持续6周。Con和AS组给予相同体积蒸生理盐水。所有治疗均采用灌胃(i.g.)给药。结果:1.血清4项血脂指标的检测结果表明,SAA能显著改善高脂饮食诱导大鼠的血脂紊乱;2.HE染色和油红O染色显示,SAA可抑制AS大鼠主动脉内膜病变的发展;3.生化检测结果显示,SAA能显著提高主动脉超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxi-dase,GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase,CAT)等酶的活性,降低主动脉丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)的含量,降低脂质过氧化,从而改善高脂饮食诱导AS大鼠的抗氧化能力;4.ELISA检测结果显示,AS大鼠血清中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平显著上调,而SAA显著抑制上述因子的过度表达;5.WB检测结果显示,AS大鼠Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4),髓样分化因子88(myeloid differentiation factor-88,MyD88),核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB),p47phox,p22phox表达水平明显增高,而SAA能够抑制其过度表达;6.WB检测结果显示,AS大鼠核因子κB抑制因子α(alpha inhibitor of NF-κB,IκBα),转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)和血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表达水平显著下降,而SAA能上调其表达水平。第三部分SAA对内皮细胞损伤的保护作用及机制研究目的:本研究的主要目的是探讨SAA对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤的保护作用并基于SAA对相关蛋白的调控阐明其潜在的保护机制。方法:在HUVECs处于对数生长期时用80μg/mL ox-LDL处理24 h诱导内皮损伤模型,并分组如下:1)空白对照组:HUVECs标准ECM培养液孵育27 h;2)内皮损伤模型组:HUVECs标准ECM培养液孵育3 h+80μg/mL ox-LDL孵育24 h;3)低剂量SAA治疗组:含SAA(10~(-5) M)HUVECs标准ECM培养液孵育3 h+80μg/mL ox-LDL孵育24 h;4)高剂量SAA治疗组:含SAA(3×10~(-5) M)HUVECs标准ECM培养液孵育3 h+80μg/mL ox-LDL孵育24 h;5)Sim阳性药对照组:含Sim(10~(-7) M)HUVECs标准ECM培养液孵育3 h+80μg/mL ox-LDL孵育24 h。结果:1.SAA对HUVECs细胞的毒性实验表明,SAA在本研究中使用的浓度(10~(-5),3×10~(-5) M)对HUVECs细胞活力没有影响;2.WB检测结果显示,ox-LDL诱导的HUVECs细胞凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin like ox-LDL receptor-1,LOX1),还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亚单位4(NADPH oxidase subunit 4,NOX4)和NF-κB表达水平显著增加,而SAA以剂量依赖性的方式抑制其过度表达;3.WB检测结果显示,ox-LDL诱导的HUVECs细胞血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)表达水平显著增加,而SAA以剂量依赖性的方式抑制其过度表达;4.ox-LDL诱导的HUVECs细胞中ROS生成显著增加,而经过SAA(10~(-5),3×10~(-5) M)孵育的HUVECs细胞中ROS生成显著减少。结论:1.SAA能够显著改善ISO诱导的MI,抑制心肌细胞钙瞬变,降低心肌收缩力,通过抑制LTCCs降低心肌细胞内Ca~(2+)浓度,从而实现MI保护作用。2.SAA能够显著改善高脂饮食诱导的AS大鼠的血脂紊乱,抗氧化和抗炎能力,从而产生ICM保护作用,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB,上调Nrf2/HO-1等信号通路有关。3.SAA可以减轻ox-LDL诱导的细胞毒性,防止内皮损伤,从而产生ICM保护作用,其潜在的保护机制可能与抑制LOX1,NOX4,NF-κB,VCAM-1和ICAM-1的表达以及抑制ROS的生成有关。


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