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丁苯酞通过Nrf2/SIRT3通路影响血管性痴呆小鼠认知功能的研究

高立伟  
【摘要】:目的:血管性痴呆(vascular dementia,VD)是一种由脑血管疾病引起的脑部血流量(cerebral blood flow,CBF)降低或阻断导致以学习、记忆等功能障碍为主的一种获得性智能损害综合征。研究证明丁苯酞(butylphthalide,NBP)可以改善认知功能障碍,但其具体机制目前尚未完全阐明。本实验通过建立VD小鼠模型,观察丁苯酞在核转录相关因子2(Nuclear transcription factor 2,Nrf2)/沉默调节蛋白3(Silencing regulator 3,SIRT3)通路中的作用。方法:以ICR背景的雄性小鼠作为研究对象,采用反复三次结扎小鼠双侧颈总动脉的方法建立脑缺血再灌注致认知功能障碍的小鼠模型,灌胃给予丁苯酞治疗,日1次,持续28天,共分为六组,即Nrf2~(+/+)假手术组(sham组)、Nrf2~(+/+)模型组(Nrf2~(+/+)VD组)、Nrf2~(+/+)丁苯酞低剂量治疗组(Nrf2~(+/+)NBP-L组)、Nrf2~(+/+)丁苯酞高剂量治疗组(Nrf2~(+/+)NBP-H组)和在Nrf2基因敲除小鼠的基础上进行的Nrf2~(-/-)模型组(Nrf2~(-/-)VD组)和Nrf2~(-/-)丁苯酞治疗组(Nrf2~(-/-)NBP组)。应用Morris水迷宫实验分析各组小鼠认知功能,包括定位航行实验和空间探索实验。采用HE染色法观察小鼠海马CA1区神经元形态结构的变化,免疫组化方法分析小鼠海马CA1区半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase3)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9,Caspase9)的阳性表达,Western blot法检测小鼠海马组织中的Nrf2、SIRT3、P62和LC3蛋白表达。结果:1水迷宫结果1.1 NBP能够改善VD小鼠的认知功能同假手术组比较,Nrf2~(+/+)VD组逃避潜伏期(入水到找到平台的时间)明显延长,目标象限(即原平台所在象限)停留时间百分比显著减少,差异有统计学意义(P0.05);而同Nrf2~(+/+)VD组比较,Nrf2~(+/+)NBP-L组与Nrf2~(+/+)NBP-H组逃避潜伏期明显缩短,目标象限停留时间百分比明显增加,差异具有统计学意义(P0.05);Nrf2~(+/+)NBP-H组同Nrf2~(+/+)NBP-L组相比,逃避潜伏期缩短,目标象限停留时间延长,但差异没有统计学意义(P0.05)。1.2 NBP对Nrf2~(+/+)和Nrf2~(-/-)VD小鼠的认知功能的影响同Nrf2~(+/+)VD组比较,Nrf2~(-/-)VD组逃避潜伏期延长;目标象限停留时间百分比减少,差异有统计学意义(P0.05);与Nrf2~(-/-)VD组比较,Nrf2~(-/-)治疗组逃避潜伏期缩短,目标象限停留时间百分比增加,但差异没有统计学意义(P0.05),且Nrf2~(+/+)治疗组与Nrf2~(-/-)治疗组比较逃避潜伏期明显缩短,目标象限停留时间百分比显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。2 HE染色结果同Nrf2~(+/+)sham组相比,Nrf2~(+/+)VD组小鼠海马CA1区锥体神经元排列松散,层次欠佳,存在细胞核固缩现象,经NBP治疗后好转,CA1区锥体神经元核固缩减少,神经元结构较完整。与Nrf2~(+/+)VD小鼠比较,Nrf2~(-/-)VD小鼠海马CA1区锥体神经元形态结构损伤更为严重,散在分布,出现大量的细胞核固缩。Nrf2~(-/-)VD小鼠经NBP治疗后神经元形态改善并不明显。3免疫组织化学结果Caspase3、Caspase9阳性细胞在细胞浆中表达,呈棕黄色。与sham组小鼠相比,Nrf2~(+/+)VD组小鼠海马CA1区阳性细胞表达明显增多(P0.01),而经NBP治疗后,Caspase3、Caspase9阳性细胞表达明显减少(P0.01),但NBP-H组较NBP-L组表达未见明显差别(P0.05)。同Nrf2~(+/+)VD组相比,Nrf2~(-/-)VD组Caspase3、Caspase9阳性细胞表达更多(P0.01),且在NBP治疗后Caspase3、Caspase9阳性表达差异没有统计学意义(P0.05)。4 Western blot结果4.1 NBP对Nrf2/SIRT3通路起到影响与sham组相比,Nrf2~(+/+)VD组的Nrf2蛋白表达明显升高(P0.01),SIRT3蛋白表达明显降低(P0.01);经过NBP治疗后,VD小鼠的海马Nrf2、SIRT3蛋白均升高(P0.01);同Nrf2~(+/+)VD小鼠比较,在Nrf2敲除小鼠上,Nrf2~(-/-)VD小鼠Nrf2、SIRT3蛋白明显降低(P0.01),且在NBP治疗后海马Nrf2、SIRT3蛋白明显升高(P0.01),但同Nrf2~(+/+)VD+NBP治疗组比较,Nrf2~(-/-)VD+NBP治疗组Nrf2、SIRT3表达明显降低(P0.01)。4.2自噬相关蛋白P62和LC3的变化与sham组相比,Nrf2~(+/+)VD组的P62蛋白表达明显降低(P0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显升高(P0.01);经过NBP治疗后,VD小鼠的海马P62蛋白表达明显升高(P0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显降低(P0.01);同Nrf2~(+/+)VD小鼠比较,在Nrf2敲除小鼠上,Nrf2~(-/-)VD小鼠P62蛋白明显降低(P0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显升高(P0.01),NBP治疗后海马P62蛋白表达和LC3Ⅱ/Ⅰ比值的变化差异无统计学意义。结论:丁苯酞可以减轻VD小鼠海马区的凋亡损伤,改善反复缺血再灌注损伤所致的认知功能障碍。细胞自噬的过度激活在VD发病过程中起重要作用。丁苯酞可以改善VD小鼠的空间学习记忆损害及海马区病理损伤,通过调控Nrf2/SIRT3通路抑制海马区神经细胞凋亡、自噬可能是其作用机制之一。


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