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GIT2基因缺失对佐剂性关节炎(AA)大鼠关节的影响及软骨细胞分化的作用机制的研究

李辉  
【摘要】:目的:研究GIT2基因缺失对佐剂性关节炎(RA)大鼠关节的影响及软骨细胞分化的作用机制。方法:1.收集符合试验标准的健康雄性(Sprague Dawley)SD大鼠,对大鼠体征进行观察并且称量大鼠体重。2.32只大鼠随机分为正常组、模型(类风湿)组,GIT2基因敲除(GIT2-KO)和基因敲除加类风湿(GIT2-KO+)组;RT-PCR及Western-blot各组为30,总只数120。3.本研究采用弗氏完全佐剂注射于左后足跖皮内0.1ml诱导关节炎(致炎)。4.在第26d后采集大鼠足趾关节,对正常组、佐剂组、基因敲除(GIT2-KO)组以及基因敲除加佐剂组,大鼠关节组织切片进行HE染色,进行病理组织学检查。5.通过qRT-PCR和Western-blot检测白细胞介素-1β(1L-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),聚集蛋白聚糖(Aggrecan)和性别决定基因盒9(Sox9)的表达。6.利用免疫组化法检测各组的Ⅱ型胶原。7.分别对正常组、佐剂组、GIT2-KO组以及GIT2-KO+组大鼠于致炎前(0d),致炎后第10、13、17、21、24天,分别用皮尺(所用皮尺的宽度是5mm,最小刻度是0.5mm)和游标卡尺测量各组大鼠左右后足踝关节下0.5mm处的周长和直径值。肿胀度用左后足(造模侧)相对于右后足(非造模侧)的周长增加值和增加百分比表示其肿胀度。结果:1.CFA诱导建立RA模型,造模第0、10、13、17、21和24天分别称重,比较各组大鼠的体重。结果如表1所示。在初始RA诱导当天,各组大鼠体重称量差异无统计学意义(均P0.05)。然而在第10、13、17、21和24天,佐剂组大鼠体重均显著高于GIT2-KO+组,差异有统计学意义(均P0.05)。与正常组相比,GIT2-KO+组大鼠体重显著下降,差异有统计学意义(均P0.05)。GIT2-KO组大鼠体重与正常组无显著差异。2.HE染色结果显示与正常组相比,GIT2-KO组的滑膜组织除了出现较厚的滑膜组织外,还有不同程度的更严重的RA表现,其中炎性细胞也有明显的浸润。GIT2-KO+组中的滑膜组织明显更厚,被更多的炎性细胞浸润,并且在软骨损伤方面表现出更大的严重性。3.根据免疫组化分析结果可知,II型胶原在正常组的大鼠的软骨组织中高度表达,而在佐剂组中显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。与正常组相比,GIT2-KO组、GIT2-KO+组大鼠软骨组织中II型胶原的表达下降(P0.05)。与GIT2-KO+组相比,佐剂组与GIT2-KO组中的大鼠软骨组织中II型胶原的表达均显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。4.大鼠软骨组织肿胀程度结果显示,在RA诱导初始,各组大鼠软骨组织肿胀程度无显著区别,差异无统计学意义(均P0.05)。然而在第10天以后,相比于正常组,GIT2-KO组大鼠软骨组织肿胀程度显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。相比于佐剂组,GIT2-KO+组大鼠软骨组织肿胀程度更高,差异有统计学意义(P0.05)。5.qRT-PCR和Western-blot检测IL-1β,TNF-α,Aggrecan和Sox9的表达,qRT-PCR结果显示佐剂组IL-1β,TNF-α,Aggrecan和Sox9的表达均低于GIT2-KO+组;Western-blot结果显示佐剂组IL-1β,TNF-α,Aggrecan和Sox9的蛋白表达均低于GIT2-KO+组(P0.05)。在第10天以后,与正常组相比,各组IL-1β,TNF-α,Aggrecan和Sox9的mRNA表达水平在第10天以后逐渐升高,且显著高于正常组水平,差异有统计学意义(P0.05)。与正常组相比,GIT2-KO组IL-1β,TNF-α,Aggrecan和Sox9的表达和蛋白表达水平均较高(P0.05)。结论:1.CFA诱导10天后,RA佐剂组大鼠体重显著降低,而GIT2基因缺失对大鼠体重无显著影响。2.GIT2基因表达缺失进一步诱导佐剂性关节炎关节滑膜组织炎症反应的发生。3.GIT2基因表达缺失引起大鼠软骨组织中II型胶原的表达下降。4.GIT2基因表达缺失加重大鼠关节软骨组织肿胀程度。5.GIT2基因表达缺失引起关节软骨组织中IL-1β,TNF-α,Aggrecan和Sox9的mRNA及蛋白表达水平上调。6.GIT2基因表达缺失可导致类风湿性关节炎软骨细胞分化功能减弱;本研究可为类风湿性关节炎发病机制的研究提供一定的理论依据。


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