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姜黄素对糖尿病视网膜病变PI3K/Akt/mTOR通路的调控作用

冉振龙  
【摘要】:第一部分姜黄素对DR大鼠视网膜PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响目的:探讨姜黄素对DR大鼠模型视网膜组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关因子的表达水平进行检测,旨在明确姜黄素对DR的作用及相关机制,为姜黄素应用于临床上DR的治疗提供实验依据。方法:1.建立糖尿病视网膜病变大鼠模型,将大鼠分为对照组(control),DR组,不同浓度姜黄素组(0.25μg/μL,0.5μg/μL,0.75μg/μL)。采用HE染色观察各组大鼠视网膜病理样本。2.采用荧光定量PCR法分别检测各组大鼠视网膜组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达的情况。3.采用western bolt法分别检测各组大鼠视网膜组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的情况。结果:1.control组大鼠视网膜结构完整。DR组大鼠视网膜结构均表现为不同程度的水肿,其结构完整性被破坏且凌乱疏松,内外颗粒层细胞肿胀、排列紊乱无序,细胞间隙增大,视野下能够观察到毛细血管扩张,有的可见充血,内外丛状层可见明显肿胀,外丛状层能够观察到散在的新生血管。0.25μg/μL组视网膜各层结构变化与DR组大鼠视网膜病理变化较为相近;0.5μg/μL组大鼠大鼠视网膜结构大致完整,各层的水肿情况较0.25μg/μL组减轻;0.75μg/μL组大鼠视网膜结构基本完整,各层基本未观察到水肿现象,内外颗粒层细胞排列较为规整,内丛状层与外丛状层的肿胀情况较DR组明显改善,各层均未观察到毛细血管扩张、充血现象,未观察到新生血管;2.与control组相比,DR组大鼠视网膜组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达水平均明显升高(P0.05);与DR组相比,各姜黄素浓度组大鼠视网膜组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达水平均明显降低(P0.05),且随着姜黄素作用浓度的升高,PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达水平则越低;3.与control组相比,DR组大鼠视网膜组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达水平均明显升高(P0.05);与DR组相比,各姜黄素浓度组大鼠视网膜组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达水平均明显降低(P0.05),且随着姜黄素作用浓度的升高,PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达水平则越低。第二部分姜黄素调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞炎症损伤保护作用的研究目的:探讨姜黄素在缓解高糖诱导RPE的炎性因子分泌、ROS产生、PI3K/Akt和mTOR活化中的作用,旨在为防治糖尿病视网膜病变新药物的开发奠定基础。方法:1.将ARPE-19细胞随机分为5组,对照组(control),高糖处理组(HG),HG+不同浓度姜黄素组(CUR1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L),对各组进行CCK-8细胞检测。2.将ARPE-19细胞随机分为(一)control组,HG组,甘露醇组(Mannitol);(二)control组,HG组,HG+N-乙酰半胱氨酸组(HG+NAC),HG+LY294002组,HG+Rapamycin组。采用ELISA法检测分组一和分组二各组细胞培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的含量。采用激光共聚焦显微镜检测分组一各组细胞中的ROS。采用western blot法分别检测分组二各组细胞中Akt、pAkt、mTOR、p-mTOR蛋白的表达水平。3.将ARPE-19细胞随机分为control组,HG组,HG+NAC组,NAC组,采用western blot法分别检测各组细胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表达水平。4.将ARPE-19细胞随机分为control组,HG组,HG+CUR 10μmol/L组,CUR 10μmol/L组,采用ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的含量,采用激光共聚焦显微镜检测各组细胞中ROS水平,采用western blot法分别检测各组细胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表达水平。结果:1.不同浓度葡萄糖作用于ARPE-19细胞,12 h后细胞的增殖活性均受到明显抑制(P0.05),用30 mmol/L葡萄糖作用细胞时,ARPE-19的增殖活性随时间的推移逐渐降低。当采用不同浓度甘露醇作用于细胞时,ARPE-19的增殖活性未受到影响(P0.05),采用24.4mmol/L的甘露醇作用细胞时,各时间点ARPE-19的增殖活性未受到影响(P0.05)。采用不同浓度姜黄素作用细胞时,ARPE-19的增殖活性未受到影响(P0.05),当采用10μmol/L姜黄素作用细胞时,各时间点ARPE-19的增殖活性未发生明显变化(P0.05)。而采用5或10μmol/L姜黄素进行预处理1 h,随后再用葡萄糖作用细胞时,结果显示ARPE-19细胞的增殖活性较高糖组均明显增高(P0.05);2.采用30mmol/L葡萄糖处理细胞12 h后,各组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平较对照组明显升高(P0.01);而采用24.4mmol/L甘露醇作用细胞后IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平较对照组无明显变化(P0.05)。30mmol/L葡萄糖处理细胞后ROS的含量明显增高(P0.01),而24.4mmol/L甘露醇作用后细胞中ROS水平无明显变化(P0.05)。用30 mmol/L葡萄糖刺激12 h后ARPE-19中p-Akt和p-mTOR蛋白水平增加(P0.01),而采用24.4mmol/L甘露醇作用细胞后p-Akt和p-mTOR蛋白水平无明显变化(P0.05)。采用PI3K抑制剂LY294002,mTOR抑制剂Rapamycin和抗氧化剂NAC预处理细胞1 h后,其培养上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平均较单纯高糖环境下培养的细胞明显降低(P0.01);3.用抗氧化剂5mmol/L NAC预处理细胞1h后,随后再将细胞放于高糖环境下培养,此时细胞中p-Akt和p-mTOR蛋白的表达水平较单纯高糖环境下培养的细胞明显降低(P0.01);4.ARPE-19中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平在10μmol/L姜黄素预处理后,较高糖组显著降低(P0.01)。采用姜黄素进行预处理,随后再将细胞培养于高糖环境下,此时细胞中ROS水平以及p-Akt、p-mTOR表达水平均显著降低(P0.01)。第三部分PI3K/Akt/mTOR信号通路相关因子在DR大鼠玻璃体中的表达及意义目的:对不同造模时期的糖尿病大鼠的视网膜进行病理观察,检测对相应时期的玻璃体液中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关因子,旨在为寻找该病治疗的新途径奠定基础。方法:1.采用链脲佐菌素溶液(60mg/kg)行腹腔注射,建立糖尿病大鼠模型;用血管内皮生长因子溶液行玻璃体腔注射,建立糖尿病视网膜病变大鼠模型。将大鼠分为对照组(control),注药后2周组(2W)、4周组(4W)、8周组(8W)。2.采用HE染色观察各组大鼠视网膜病理样本。3.采用ELISA法对各组大鼠玻璃体液行PI3K、Akt、mTOR蛋白检测。结果:1.糖尿病大鼠空腹血糖均≥16.7mmol/L,造模成功率100%;2.control组大鼠视网膜结构完整。2W组可见视网膜内、外颗粒层细胞稀疏,排列略紊乱,内、外丛状层可见空泡样改变。4W组见内、外颗粒层细胞进一步稀疏,排列紊乱,并可见空泡样改变,内、外丛状层空泡样改变。8W组视网膜结构均表现为不同程度的水肿,其结构完整性被破坏且凌乱疏松,内外颗粒层细胞肿胀、排列紊乱无序,细胞间隙增大,视野下能够观察到毛细血管扩张,有的可见充血,内外丛状层可见明显肿胀,外丛状层能够观察到散在的新生血管;3.与control组相比,2W组、4W组、8W组大鼠玻璃体液中PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达水平均显著增高(P0.05)。结论:1.DR大鼠视网膜PI3K/Akt/mTOR通路相关分子显著增高;各分子对应的mRNA同时相应升高;姜黄素对DR大鼠视网膜具有保护作用;其机制可能与PI3K/Akt/mTOR通路相关,并且呈剂量依赖性。2.高糖环境下,RPE中TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子的表达增加,ROS含量增高,Akt和mTOR的磷酸化水平升高;抗氧化剂NAC、PI3K/Akt抑制剂、mTOR抑制剂能阻断高糖诱导的RPE中炎症因子的表达;姜黄素具有与ROS/PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂类似的功能,能够通过干扰ARPE-19中的ROS-PI3K/Akt/mTOR信号传导,降低高糖诱导的炎性损伤。3.通过STZ腹腔注射方法可以获得满意的糖尿病动物模型;结合玻璃体腔注射VEGF可以获得理想的DR动物模型;随糖尿病病程时间延长,视网膜病变逐渐加重;玻璃体内PI3K、Akt、mTOR分子随病情加重而增加。


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