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花粉PLC活性检测、cDNA克隆及功能分析

潘延云  
【摘要】: 我室前期药理学实验证明外源纯化的钙调素可促进花粉萌发和生长,位于质膜内侧的异三聚体G蛋白对该过程也有调节作用。在这个过程中,细胞外钙调素可能是异三聚体G蛋白参与调控的质膜外信号之一,而G蛋白跨膜传递了这一信号。细胞外钙调素信号转导的工作模型初步建立(马力耕和孙大业,2000)。支持这一模型的还有我室的有关肌醇磷脂系统的大量药理学实验(马力耕等,1998)以及采用显微注射(Microinjection)技术和激光共聚焦技术等得到的大量数据(王昕等,2000;尚忠林等,2001)。这些结果均表明,磷脂酶C信号系统也可能参与了花粉管伸长过程的调节,并且可能由G蛋白介导参与了细胞外CaM的跨膜信号转导过程。 为了给上述信号转导过程提供进一步的证据,本文以百合花粉为材料,从PLC活性的测定、PLC基因的克隆及其与花粉萌发的关系、以及PLC活性被G蛋白和CaM调控等方面,为肌醇磷脂系统参与花粉萌发和细胞外钙调素的信号转导过程进一步提供了分子生物学和生物化学的证据。本文还利用PLC相关突变体及其超表达转基因拟南芥为材料,进一步检测了PLC基因突变和超表达对花粉的萌发和花粉管生长的影响,从分子水平上提供了PLC参与花粉萌发和生长的直接证据。 实验中,利用[~3H]PIP_2和花粉原生质体共同孵育的体系,检测出了百合花粉细胞具有依赖PIP_2的PLC活性;利用该体系还检测出外源钙调素可促进PLC的活性,其中10~(-9)M的钙调素可使PLC的活性提高三倍;异三聚体G蛋白的激活剂CTX可以激活PLC的活性,而其抑制剂PTX可明显抑制PLC活性;外源钙调素的这种作用可以被PTX抑制;而PLC抑制剂U-73122抑制CTX对PLC的激活效应。利用confocal技术检测了PLC对花粉细胞游离钙离子的影响,观察到U-73122抑制细胞质游离钙离子水平的升高和钙震荡。上述结果表明,在花粉体系中,PLC-IP_3-Ca~(2+)做为G蛋白的下游组分,参与了G蛋白介导的胞外CaM的信号传递途径。 本文首次从百合花粉中克隆了两个PLC基因(LdPLC1和LdPLC2)。序列分析表明,两条cDNA都含有构成催化中心的X、Y结构域和C端C2调节域,但N末端的EF手形结构较其他植物PLC有差异。Northern和RT-PCR分析,发现随着花粉的萌发,LdPLC2的转录活性提高,而LdPLC1 博士学位论文 在萌发前后的转录水平没有变化,推测至少LdpLCZ参与了对花粉萌发的 调控。本文还利用酵母双杂交体系检验了PLC与G蛋白各亚基的相互作 用,发现LdPLCI与GQ和GY的杂交结果为阴性,与Gp亚基可发生相 互作用;LdPLCZ与Gp弱相互作用,与其他亚基没有作用。上述结果表 明在G蛋白和PLC的相互作用中,p亚基可能起调节作用。百合花粉PLC 的克隆及分析为PLC存在并参与花粉萌发和生长提供了分子水平的证 据,也使胞外CaM的信号及传递假说开始有分子生物学方面的依据。 本文最后还构建了拟南芥PLC的双元载体,经遗传转化得到了PLC 超表达拟南芥。以超表达体和该基因的相关突变体为材料,检测了PLC 基因突变和超表达对花粉萌发和花粉管伸长的影响,结果表明,与野生 型相比,PLC基因突变和超表达植株的花粉萌发率和生长速度均有显著 性差异存在。该文还对拟南芥不同亚型PLC之间的相互关系做了初步探 索,发现PLC同工酶之间在转录表达上可能存在着彼此的相互作用。上 述结果进一步为PLC调控植物花粉萌发提供了分子水平的证据。


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