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红豆杉细胞培养中紫杉醇代谢调节的研究

贾宁  
【摘要】: 紫杉醇是从红豆杉植物中提取的一种新型抗癌药物。紫杉醇在植物组织中的含量很低,而且植物组织或其细胞培养物的粗提样品中含有较多的杂质不宜分离。高效液相色谱(HPLC)逐渐显示出在分离、检测紫杉醇和BacctinⅢ等化合物方面的优势。采用岛津SPD-10AVP型HPLC,乙腈:水梯度洗脱检测,可以精确分离紫杉醇及其前体物质,紫杉醇和BacctinⅢ在0.01-0.25mg/ml范围内峰面积和浓度线性良好,结果标准曲线方程为:紫杉醇C=2.4×10~(-8)×S-0.002;BaccatinⅢC=2.9×10~(-8)×S-0.014。精密度RSD<2%(n=5)。 植物生长调节物质在细胞生长和物质代谢过程中起着重要的作用。高浓度的NAA不利于紫杉醇的合成,而降低NAA的浓度对愈伤组织的生长影响较小。当Z_3激素浓度NAA:6-BA为2:0.5时,紫杉醇含量明显增高,而生长率仅稍有降低。因此,选用NAA 2.0mg/l,6-BA 0.5mg/l作为Z_3细胞生产紫杉醇的激素组合。液体培养条件下,接种量是影响细胞生长和代谢的重要因子。高的细胞接种量(8g/40ml)虽然有较低的平均生长率,但是它有较高的生物量合成,紫杉醇的含量也很高。 实验证实在液体培养时BacctinⅢ大部分外渗。细胞BacctinⅢ外渗与细胞状态并无相关性。液体培养的细胞整个生长周期内细胞活力比较稳定,在生长周期的第12天时即对数生长期末,细胞活力开始下降,此时可以作为细胞继代的最佳时期。 培养基的pH值影响细胞的生长、代谢。液体培养时细胞生长迅速,pH值先下降后上升。实验表明灭菌前培养基pH值为6.0,是细胞生长、代谢的最适pH值。培养基中加入pH值缓冲液,可以使pH相对稳定,改善细胞BacctinⅢ外渗,提高细胞中的紫杉醇含量。在此基础上添加紫杉 河北师范大学2003届硕士研究生学位论文 醇侧链前体,能进一步促进紫杉醇的合成。此外降低培养基渗透压的方法 亦能改善细胞Bacctinln外渗,使紫杉醇有所提高。 电镜观察结果表明植物细胞的超微结构和细胞代谢特征、次生代谢物 的积累有明显相关。次生代谢物含量高的细胞中有类似的结构特征:细胞 质浓厚,内容丰富,细胞器丰富,质体发达;次生代谢物含量低的细胞则 相反。采用合适材料,可以进一步揭示植物培养物分化与次生代谢产物积 累的相关性。


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