小麦（Triticum aestivum L.）苗期水分胁迫诱导表达差异cDNA的研究

【摘要】： 干旱是导致植物发生水分胁迫的一种最重要的环境因子，极大限度地制约着作物的生长和产量。因此，研究作物的抗旱机制、培育抗旱新品种已成为当前许多科研工作者的迫切需要。 差异显示反转录聚合酶链式反应，简称DDRT-PCR。因其操作简单、快速、灵敏性高、易重复等优点，自1992年由Liang Peng和Dr．Pardee发明以来，已成为分子生物学领域一种强有力的工具，被广泛地用来分离差异表达的基因。 本研究以小麦旱选10号为材料，用16％(ψ=-0.5MPa)PEG-6000溶液处理其幼苗，采用mRNA差异显示技术和银染技术，对经过不同胁迫时间诱导表达的小麦基因进行分离，共得到差异表达的cDNA片段52条。方法是：用16％(ψ=-0.5MPa)PEG-6000溶液处理小麦幼苗，用去离子水培育幼苗做对照；分别提取处理和对照幼苗的总RNA，反转录后进行PCR扩增，PCR产物经6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色后可观察到清晰的条带。差异显示的PCR产物长度绝大部分在150bp到750bp之间。所回收的52条筹异带，经Reverse Northern．验证后，得到阳性表达的cDNA片段15个，其中包括4个“上调”基因和11个“下调”基因。用单个随机引物对上述15个片段进行再次扩增，全部表现为阴性。对15个阳性cDNA片段克隆并测序，通过与GenBank中的EST数据库比对，结果发现——11个cDNA片段与已知序列有较高的同源性，4个为未知基因序列。其中，受水分胁迫处理诱导表达信号增强的cDNA片段WSI732与高粱苗期病菌感染诱导的cDNA clone同源性为86％，WSI483与小麦休眠期胚乳、ABA处理的小麦胚cDNA clone、小麦苗期干旱胁迫处理的cDNA clone同源性为100％，与盐胁迫处理的大麦根cDNA clone同源性为99％，WSI153与小麦20天的穗、 郭宾会:小麦(Trltl。。，aestl。用L)苗期水分胁迫诱导表达差异cDNA的研究兰 开花后30一45大的种子CDNA clone同源性为100%。另外8个受水分胁迫处 理诱导表达信号减弱的cDNA片段序列分别与冷胁迫处理诱导的小麦幼苗、 小麦胚乳、人麦苗期根芽、小麦自化苗、镰刀菌感染的小麦穗、高粱苗期叶 及水稻芽期等植物组织CDNA clone同源性高达85%以上。另外4个差异片 段同源性非常低(小于30cy0)，可能为新的基因序列，其功能有待于进一步 研究、鉴定。其中，盯八了夕夕在受到水分胁迫处理48h后强烈表达，Reverse Northern验证也得到同样结果，该基因片段在GenBank查询与已知序列儿 乎无任何同源性，断定为新的基因序列，其基因全长及其功能鉴定有待于进 一步的研究。