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多枝赖草逆境胁迫应答基因的分离与鉴定

宋丽  
【摘要】: 土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题,随着工业污染加剧,灌溉用水的质量不断下降和化肥使用不当等原因,次生盐碱化土壤面积有不断加剧的趋势,给农业生产造成重大损失;黄矮病毒病是小麦等禾本科植物的重要病害之一,其传毒介体蚜虫更使植物产量损失巨大。因此,植物耐盐、耐黄矮病、耐蚜虫等机理和相应耐性植物的培育,乃至相应耐性相天基因的分离与克隆及其基因工程育种的研究正在受到人们越来越多的关注。我国新疆重要天然草种多枝赖草,分布于盐渍化荒漠草甸,目前已被证实具有突出的耐干旱、耐盐碱、耐黄矮病、耐蚜虫、耐瘠薄、耐污染等优异抗逆特性。这些特性都是目前种植的大多数农作物、牧草与草坪草栽培品种,本身缺乏急需改良的特性。因此,分离克隆控制这些优异抗逆特性的功能基因,非常必要。 本研究就是利用近年来发展起来的DDRT-PCR技术,研究了高度耐黄矮病耐蚜虫的二体异附加系Line24及其感病虫小麦亲本‘中国春’、‘丰抗13’在接种带有大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus,简称BYDV)GAV株系的蚜虫、不带有BYDV-GAV株系的蚜虫及不接蚜虫三种处理下不同时期基因表达的差异;亦研究了高度耐盐的小麦-多枝赖草二体异附加系Line14及其敏盐小麦亲本‘中国春’、‘丰抗10’在盐胁迫和非盐胁迫下不同时期基因表达的差异。采用3条锚定引物和8条随机引物共计24种组合,获得了6480条耐病材料cDNA扩增条带,其中91.8%在不同处理条件下是非常一致的。在表现差异的条带中,共分离得到了12条Line24特异表达条带,其中8条是有毒蚜诱导下的带,3条是有毒蚜、无毒蚜和不接蚜虫处理下均表达的带,1条是有毒蚜和无毒蚜处理下均表达的带;也获得10800条耐盐材料cDNA扩增条带,其中89.5%在不同处理条件下是非常一致的。在表现差异的条带中,共分离得到了14条盐胁迫诱导下Line14特异表达条带,其中12条筹异带在6h的材料中获得,2条在6h,24h,48h中均有表达。选择8条Line24利9条Line14的特异表达条带进行克隆与测序,在Genbank中进行blast比较后,有的条带与小麦中已知片段具有高度同源性,选取6条与genebank中的EST序列相关性较小的片段,进行 宋丽:多枝赖草逆境胁迫应答基因的分离与鉴定 Northem杂交验证,结果耐病NB14片段与所有感病虫小麦亲本均无杂交信号,而与耐病 虫材料Line24有阳性杂交信号;耐盐NY13片段与所有敏盐小麦亲本均无杂交信号,而与 耐盐材料Line14及其耐盐亲本多枝赖草均有阳性杂交信号,说明NY13片段确实是多枝赖 草特有的与盐胁迫应答基因相关的EST。继续用NY13片段为探针,进行Southern杂交分 析,结果只与多枝赖草有杂交信号,且信号强,进一步证实该EST是多枝赖草总基因组 DNA本身所具有的特异序列,杂交片段本身很可能是多枝赖草六侧协迫应答新基因之一或其 一部分。继续回收杂交信号处的ONA片段,连接到可转化人l_染色体(TAC)载体上, 构建成含有多枝赖草盐胁迫应答基因的TAC克隆,以期今后通过耐盐功能互补实验验证而 直接用于基因_「程育种,井可进一步筛选分离获得耐盐相关基因。


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