黑曲霉糖化酶基因在荧光假单胞菌中的表达

【摘要】：葡萄糖淀粉酶简称糖化酶,可水解淀粉、糊精、糖原等物质,产物为葡萄糖。在工业发酵生产酒精、淀粉糖、有机酸、氨基酸等过程中,淀粉液化后的糖化酶糖化作用是必不可少的工序。因此许多生产糖化酶的企业都在努力增加糖化酶的生产量,提高经济效益。丝状真菌黑曲霉(Aspergillus niger)分泌的糖化酶热稳定性和耐酸性都很高,是我国糖化酶工业生产的主要菌种。为了进一步了解糖化酶分泌的机理,近年来运用分子生物学、生物化学和基因工程手段对糖化酶生物合成途径、编码基因及基因调控方面的研究成为热点。 D-异抗坏血酸作为一种食品添加剂,有着广阔的市场。荧光假单胞菌(PseudomonasTluorescens)可应用于工业发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸,在此过程中,先利用糖化酶将淀粉糖化为葡萄糖,葡萄糖经荧光假单胞菌发酵生产出2-酮基-D-葡萄糖酸,2-酮基-D-葡萄糖酸经进一步加工生产出D-异抗坏血酸。目前我国生产的2-酮基-D-葡萄糖酸占世界总产量的50%以上(孙文敬等,2004)。 本研究目的是得到一种导入糖化酶基因的荧光假单胞菌工程菌,希望这种荧光假单胞菌分泌糖化酶,并直接以淀粉代替葡萄糖作为底物发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸。达到省略工业生产2-酮基-D-葡萄糖酸过程中糖化酶糖化工序,缩短发酵时间,节约成本,提高经济效益的目的。 本研究将黑曲霉糖化酶基因cDNA按正确的读码框架克隆到广宿主表达载体pBBR1MCS-2、pUCP19-K中得到重组质粒pBBR1MCS-2GA、pUCP19-KGA,分别转化2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株荧光假单胞菌AR4,得到重组荧光假单胞菌ARW4、ARH4。希望工程菌ARW4、ARH4可分泌糖化酶,经SDS-PAGE凝胶电泳分析,发现导入糖化酶基因的荧光假单胞菌ARW4的总蛋白与未导入基因的荧光假单胞菌AR4总蛋白相比,在分子量约为70.5kD处多了一条蛋白条带。此条带与糖化酶的蛋白分子量相一致,估计可能是所要表达的糖化酶蛋白带,为确定此蛋白带,用黑曲霉糖化酶免疫白兔,制备了黑曲霉糖化酶多克隆抗血清,Westernblot结果显示正常兔血清没有印迹上蛋白带,相比糖化酶多克隆抗血清在70.5kD处印迹出1条蛋白带,证明这条蛋白带就是表达出的糖化酶。但经SDS-PAGE凝胶电泳分析,表达出的糖化酶主要以不溶性包涵体形式存在,改变和优化诱导条件未能使目的蛋白得到可溶性表达,生物测定显示重组菌未能分泌有活性的