拟南芥质膜定位的4个推测的钙调素结合蛋白的分析验证

【摘要】： 在植物中,我们实验室和其他实验室的研究结果表明,钙调素(calmodulin, CaM),这一类传统上被认为细胞内重要的Ca2+传感蛋白,在细胞外也是广泛存在的,并且发挥着非常重要的生物学功能。根据这些实验结果,我们实验室提出了细胞外钙调素可能是一种植物多肽信使的观点,并且建立了细胞外钙调素信号转导机制的假设模型。依据该模型,细胞外钙调素与存在于细胞外或质膜上的受体结合,进而激活下游信号通路,最终调节植物的生理功能及基因表达。最近,Cui等人利用35S标记CaM的方法,证明了拟南芥悬浮培养细胞和原生质体表面存在着细胞外CaM受体样结合蛋白。但是,细胞质膜上与钙调素结合的蛋白是什么,我们并不清楚,为此,我们进行了以下的实验来研究拟南芥细胞膜上和钙调素结合的蛋白质。 我室前期工作首先提取了拟南芥悬浮培养细胞的微粒体膜蛋白,其次利用钙调素亲和层析及质谱分析,从抽提蛋白中,纯化鉴定得到了35种蛋白,并且通过生物信息学分析的方法,对这些蛋白质的性质进行了简单的描述,然后瞬时转化洋葱表皮细胞,荧光显微镜观察表明,其中有5种蛋白质在质膜有明显的分布。 但是,这些蛋白质在植物体内是否和钙调素结合,还需要通过其他实验手段来进一步证明。为此本实验首先利用酵母双杂交和荧光共振能量转移的技术对这些候选蛋白和钙调素的相互作用进行了进一步的验证。酵母双杂交结果表明,4个候选蛋白质PCaMBP1、PCaMBP2、PCaMBP3、PCaMBP4都可以和钙调素发生相互作用。但是采用洋葱表皮细胞瞬时共表达系统,荧光共振能量转移分析,只证实其中的PCaMBP4可以和钙调素结合。 另外,本实验还对一些拟南芥T-DNA插入突变体进行了DNA水平的初步筛选。