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镉致河南华溪蟹精巢氧化损伤与细胞凋亡机制的研究

徐团  
【摘要】:本文采用急性毒性实验方法,研究了镉(Cd2+)对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)精巢的氧化损伤及细胞凋亡的影响。实验设置了5个CdCl2处理组(7.25、14.50、29.00、58.00、116.00 mg/L)和一个对照组,时间为1、3、5和7d。为了研究Cd2+对精巢氧化应激的影响,分别检测了超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。为了探讨Cd2+是否在对精巢氧化损伤后进一步引起生精细胞发生凋亡,分别采用苏木素-伊红(H.E.)染色法、显微与亚显微技术和琼脂糖凝胶电泳法,从细胞形态学和生物化学水平检测生精细胞的凋亡。另外,对Cd2+诱导精巢细胞凋亡的机制进行了初步探索。以不同浓度Cd2+处理7d,分别测定了过氧化氢(H2O2)含量、半胱天冬酶-3(Caspase-3)、半胱天冬酶-9(Caspase-9)和细胞色素c氧化酶(CCO)活性。结果显示: (1)精巢中SOD、GPx、CAT活性随着Cd2+浓度的增加和处理时间的延长呈现先升后降的趋势。低浓度Cd2+可以显著诱导抗氧化酶活力的升高;当Cd2+浓度增大且处理时间延长,酶活力下降并低于对照组水平。MDA含量随着Cd2+浓度的增加和处理时间的延长呈现逐渐升高的趋势。抗氧化酶活力的抑制和MDA含量的升高,表明精巢发生了严重的氧化损伤。 (2)H.E.染色发现,对照组生精上皮中生精细胞排列有序,形态结构完整,管腔中无脱落的生精细胞。随着Cd2+浓度的增加和时间的延长,出现生精细胞排列紊乱、生精细胞与精子数量减少、生发层出现空泡等组织病理学变化。荧光显微镜观察发现,凋亡的生精细胞逐渐增多。透射电镜(TEM)观察发现,生精细胞出现典型的凋亡特征,具体表现为细胞膜破裂、线粒体空泡化和核膜皱缩等。琼脂糖凝胶电泳图谱也出现凋亡细胞所特有的DNA梯状条带。 (3)处理7d后,随着Cd2+浓度的增加,H202含量、Caspase-3和Caspase-9的活力呈现逐渐升高的趋势,而CCO活力呈现逐渐下降的趋势。表明镉诱导生精细胞产生了大量的活性氧自由基,破坏了线粒体中的电子传递链,并通过Caspase-9依赖的线粒体通路导致生精细胞凋亡 结论: (1)低浓度Cd2+能够激活河南华溪蟹精巢组织中的抗氧化酶活力,以清除Cd2+诱导产生的活性氧自由基;而高浓度Cd2+则能够抑制抗氧化酶活力,使精巢中的氧化还原平衡被打破,组织中活性氧增多,细胞膜脂质过氧化加剧,最终导致精巢处于严重的氧化胁迫状态。 (2)急性Cd2+暴露能够导致河南华溪蟹生殖毒性和生精细胞凋亡,并且镉毒性作用是一个累积和渐进的过程。在镉诱导生精细胞凋亡过程中,线粒体结构与功能均受到损伤,而细胞凋亡相关的Caspase-9和Caspase-3被激活,说明镉诱导精巢细胞凋亡很可能是由Caspase-9介导的线粒体凋亡途径诱发的。 (3)MDA含量可以作为机体遭受Cd2+氧化胁迫的生物标识物,可以为水质监测、水产品健康养殖等提供科学依据。


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