二氧化硫胁迫下拟南芥防御基因的差异表达及表观遗传调控机制研究

【摘要】：逆境胁迫严重影响植物的生长发育和生产力。植物必须在分子、细胞、生理和生化水平上响应环境胁迫,通过复杂的基因调控网络,使植株做出相应的适应性调整,以求在逆境条件下得以生存。二氧化硫(Sulfur dioxide, SO2)是一种常见的全球性大气污染物。本文以模式植物拟南芥(4周龄)为材料,用浓度30mg/m3的S02暴露72h后,对拟南芥的基因表达谱、DNA甲基化特征、microRNA (miRNA)表达模式等进行了分析,研究SO2胁迫下拟南芥防御基因的差异表达及表观遗传调控机制,从DNA和转录水平上揭示植物对逆境适应的分子机制。 根据ATH1芯片检测结果,对拟南芥地上组织细胞基因表达谱进行分析,在全基因组中共检出胁迫组和对照组间差异表达2倍以上的基因494个(|R|2),其中上调表达220个,下调表达274个,主要涉及细胞代谢、结合、转录调控、结构分子、信号转导、物质运输等过程。S02胁迫后,抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)基因表达水平和酶活性增加,抗逆相关的防御基因如谷胱甘肽硫转移酶(GST)、细胞色素P450、热激转录因子、热激蛋白等转录水平提高。同时,参与抗病反应的病程相关蛋白基因、次生代谢相关基因(苯丙烷类代谢途径)、细胞壁形成相关基因(纤维素合成酶、伸展蛋白及木质素合成相关)等表达上调,诱导植物产生对多种环境胁迫的交叉抗性。对9个差异表达防御基因进行RT-PCR分析,结果表明SO2胁迫后这9个基因转录水平提高,与芯片结果一致,证明由基因芯片筛选出的差异表达基因信息是可靠的。SO2胁迫诱导拟南芥胞内超氧阴离子(O-·)和过氧化氢(H2O2)水平升高,生长素、乙烯生物合成和信号转导途径相关基因激活,活性氧和植物激素等多条途径参与了拟南芥对SO2的防卫应答反应,从而提高植株对逆境的适应性。 利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析拟南芥基因组DNA中CCGG位点甲基化状态。结果表明,采用12对随机引物组合,共扩增出703条清晰的谱带,SO2胁迫诱导胞嘧啶甲基化特征改变,甲基化多态性为37%,未甲基化和半甲基化位点减少,全甲基化位点增多,基因组DNA总甲基化水平增高,从而有利于胁迫条件下植物基因组的稳定。利用亚硫酸氢盐修饰后测序(Bisulfite sequencing, BS)技术分析SO2胁迫应答基因RD29A、类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD7)、腈水解酶(NIT2)和ACC合成酶(ACS6)的甲基化状态。结果表明,在正常生长条件下,RD29A和CCD7基因启动子检测区域中未发现甲基化,NIT2和ACS6基因启动子检测区域中的CG、CHG和CHH (H代表A、C或T)位点存在不同程度的甲基化。SO2胁迫后,RD29A和CCD7基因启动子区保持无甲基化状态不变,而NIT2和ACS6基因启动子区不同位点甲基化水平升高或降低,总甲基化水平降低。同时,NIT2和ACS6基因的转录水平提高,说明SO2胁迫诱发拟南芥基因胞嘧啶甲基化水平改变,启动子区甲基化水平的降低可能与防御基因的诱导表达有关,DNA甲基化修饰参与了植物的抗逆生理过程。 RT-PCR分析结果表明,SO2胁迫后拟南芥多个miRNA诱导表达,miR162a、miR167a、miR167c、miR319c的表达量增加：miR398a. miR398c的表达量降低,其靶基因Cu/Zn超氧化物歧化酶(CSD1和CSD2)的转录水平增加,二者表达变化呈负相关。胁迫诱导miRNA前体上游序列分析后发现,该区域存在大量的胁迫响应元件、激素响应元件,对miRNA自身的表达起到关键的调控作用,说明miRNA上游的调控因子与下游的靶标组成了一个完整的调控网络,逆境诱导miRNA表达改变对其靶基因进行负调节,参与植物的胁迫响应与抗逆调控。 研究结果表明,S02胁迫激活拟南芥胞内活性氧(H2O2)、植物激素(生长素、乙烯)等多条信号转导途径,诱导SOD、POD、 GPX, GST,细胞色素P450等多个防御基因表达水平提高。同时,热激转录因子、热激蛋白、抗病基因等表达上调,从转录水平上显示了植株对多种环境胁迫的抗性增强。拟南芥DNA甲基化特征改变对植物基因组稳定和基因转录调节具有重要作用,miRNA表达模式的改变对其靶基因进行负调控,SO2胁迫诱导的表观遗传修饰参与了抗逆基因的转录调节,是植物对逆境的一种适应性反应。