飞蝗海藻糖酶基因的分子特性及功能研究

【摘要】：海藻糖是昆虫主要的血糖成分,对昆虫机体起供给能量的作用。海藻糖酶是特异性水解海藻糖的酶,而高等动物体内缺失这一代谢过程,因此,海藻糖酶被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。本研究以重要农业害虫飞蝗为研究对象,探讨海藻糖酶基因的分子特性及功能,为飞蝗的有效治理提供一定的理论依据。主要研究内容如下：一、飞蝗海藻糖酶基因cDNA序列的获得及特征分析通过搜索飞蝗转录组,获得了3个海藻糖酶基因cDNA全长序列和1个海藻糖酶基因cDNA片段,进一步搜索飞蝗基因组获得其全长。Blast分析表明这4个海藻糖酶均含有海藻糖酶的两个功能保守区(PGGRFrEyYyWDtY和qWDyPNaWpP),以及一个甘氨酸富集区(GGGGEY)。TMHMM Server v.2.0分析发现一个基因具有跨膜结构域,将其命名为LmTreM,其余三个均为可溶性海藻糖酶,分别命名为LmTreSl、LmTreS2、LmTreS3。利用SignalP4.1 Server软件分析表明只有LmTreS3具有信号肽。二、飞蝗海藻糖酶基因在不同组织部位和发育时期的表达首先运用qPCR方法筛选得到EF-1α和β-actin为五龄飞蝗不同组织和发育时间的最适内参基因。进一步利用qPCR方法分析了海藻糖酶基因的mRNA表达,结果表明LmTreM在肌肉中特异性高表达,LmTreSl在马氏管和中后肠中表达较高,LmTreS2在体壁中表达最高,而LmTreS3在所有组织部位中相对均衡表达；之后分别选取表达最高的组织部位进行发育表达检测,发现LmTreM在五龄中期肌肉的表达量相对较高,LmTreS1在马氏管中随着发育天数增加表达量上升,在五龄中期的中后肠表达量较高,LmTreS2在体壁中随着发育时间增加表达量下降,LmTreS3在五龄飞蝗若虫发育过程中恒定表达。三、飞蝗海藻糖酶酶活测定利用己糖激酶法测定膜结合型和可溶性海藻糖酶的活性,取五龄飞蝗若虫每一天的肌肉组织进行LmTreM的活性测定,取五龄飞蝗若虫每一天的马氏管、中后肠测定可溶性海藻糖酶的活性。结果表明LmTreM在五龄第1天酶活性较高,后6天酶活性相对较低,可溶性海藻糖酶在马氏管中的活性随发育天数增加呈现逐渐升高的趋势,而在中后肠恒定表达。四、飞蝗海藻糖酶基因的功能研究为进一步研究海藻糖酶基因的功能及其对飞蝗生长发育的影响,我们采用了RNA干扰(RNAi)技术。分别注射LmTreM、LmTreS1、LmTreS2与LmTreS3的dsRNA至五龄第2天若虫,48 h后收集整虫样品提取RNA,利用qPCR技术检测4个海藻糖酶基因的沉默效率,结果表明各基因的表达均被有效沉默,且无交叉干扰现象。然而注射各基因的dsRNA后五龄若虫均可顺利蜕皮至成虫,表明海藻糖酶基因的沉默并不影响飞蝗蜕皮发育等生理功能。