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荞麦胰蛋白酶抑制剂靶向线粒体抑制细胞增殖机制初探

闫红  
【摘要】:线粒体拥有自身的遗传物质及遗传体系,是一种半自主性细胞器。线粒体约由1000种蛋白组成,但仅仅1%的蛋白由线粒体自身合成,超过99%蛋白质都是由核基因编码,在细胞质合成前体蛋白,之后转运至线粒体,经跨膜运送并分选定位于各部分。大多数前体蛋白N端含有定位分选信号被称为前导肽,能够指导其导入线粒体。重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI)是通过基因克隆、原核表达获得的一种分子量为7.9 kD的Potato I型抑制剂。前期研究已经证明,rBTI能够与线粒体外膜蛋白Tom 20相互作用,造成线粒体损伤诱发线粒体自噬进而抑制细胞增殖,这些结果都暗示rBTI能够靶向线粒体。rBTI三维结构中含有一个α螺旋,其性质与线粒体前导肽非常类似。但rBTIα螺旋是否具有类似线粒体前导肽的功能,以及它在抑制肿瘤细胞增殖中的作用还不清楚。本文将进一步探究rBTI抑制肿瘤细胞增殖的分子机制,主要通过以下内容展开:1.采用MTT法、qRT-PCR、Western Blot、免疫荧光、酶活测定和ATP含量检测分析了rBTI对Hep G2细胞糖酵解关键酶转录水平,尤其己糖激酶II(hexokinase II,HK II)在蛋白水平,活性和空间定位以及ATP水平的影响。结果表明,rBTI以时间和剂量依赖效应降低HK II的表达,减少HK II在线粒体的空间定位,破坏HK II与电压依赖性阴离子通道(Voltage Dependent Anion Channel,VDAC)的结合,引起线粒体功能障碍,导致线粒体自噬,进而抑制Hep G2细胞增殖。2.采用定点突变将亲水表面的正电荷(赖氨酸)突变为丙氨酸,获得rBTI-K20A,rBTI-K23A和rBTI-K20A/K23A三种突变体;采用胰蛋白活性、抑制常数测定和圆二色谱法分析了突变体的抑制活性和二级结构。结果表明rBTI的α螺旋结构中正电荷突变后,胰蛋白酶抑制活性保持不变,能够与胰蛋白酶形成稳定的酶抑制剂复合物,二级结构保持稳定,突变前后没有发生明显变化。3.采用MTT法、电子显微镜、激光共聚焦显微镜等分析了突变体对Hep G2、HCT116、FHC的增殖抑制作用,以及对细胞形态、线粒体形态的影响,以及在能量代谢方面对ATP水平和HK II的影响。结果表明rBTI-K20A和rBTI-K23A对正常细胞FHC没有毒性,但是对Hep G2和HCT116具有明显的增殖抑制作用。与rBTI处理组相比,rBTI-K20A和rBTI-K23A处理组,细胞形态变圆,贴壁能力减弱;线粒体自噬增强,线粒体形态由网状变为点状,分布在核周围;在能量代谢方面,rBTI-K20A和rBTI-K23A处理组,ATP水平下降更加明显;总HK II表达量显著降低。由此,我们初步证明rBTI中α螺旋具有线粒体前导肽的功能,其亲水性表面电荷突变后可以将rBTI阻断在线粒体膜上引起线粒体更大的损伤,从而抑制肿瘤细胞增殖。rBTI可能靶向线粒体基质,rBTI-K20A和rBTI-K23A可能靶向线粒体外膜,rBTI-K20A/K23A由于α螺旋没有正电荷失去与Tom 22的作用可能被阻止到线粒体外。上述结果为将rBTI开发为一种靶向线粒体的天然抗肿瘤药物提供了理论依据。


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