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基于多糖分子量分布和免疫活性比较的黄芪质量研究

曹宇欣  
【摘要】:选题依据:黄芪是山西大宗道地药材之一。多糖作为黄芪中的主要免疫活性成分,却因结构可控性难题,未能作为质控指标。近年来随着膜材料、色谱填料技术等发展,超滤法、新一代凝胶色谱法的应用,使得多糖组分可以根据分子量进行系统表征和分离。新技术、新表征方法的应用不仅可避免了多糖结构测定的技术瓶颈,而且从整体上可以精准表征中药材多糖的结构特点。基于TSK凝胶色谱法进行黄芪多糖分子量分布的糖谱表征可鉴别出不同种属、不同基原、不同生长方式下黄芪药材的差异。通过超滤法可截留制备出不同分子量黄芪多糖,为系统免疫活性筛选奠定了基础。因此本研究通过TSK凝胶色谱分离法和超滤截留法,进行不同分子量黄芪多糖糖谱表征和制备,分别进行结构研究(单糖组成、连接位点分析),同时进行非特异性和特异性免疫活性筛选(体外细胞活性评价和体内动物活性验证),找出黄芪多糖中活性最强组分,建立黄芪多糖特征糖谱结合细胞免疫活性评价方法进行不同来源黄芪质量比较。研究不仅为阐明黄芪多糖药理功能物质奠定了基础,而且促进了药物研发。目的:将黄芪多糖(APS)按分子量分布情况分离不同组分,解析各组分结构并筛选出免疫活性最强的组分。并通过建立黄芪多糖、寡糖和单糖糖谱,结合技术成熟的细胞免疫活性实验,建立以多糖为评价指标的黄芪品质评价方法。方法:(1)采用水提醇沉法对山西浑源黄芪药材中的多糖成分进行提取。并按分子量分布情况采用超滤截留的方法将APS进行分离,通过测定不同组分的单糖组成,红外光谱,甲基化和核磁共振(NMR)波谱分析比较它们之间的结构差异。(2)将制备出的三种不同分子量的APS通过体外作用于小鼠免疫细胞,用MTT法测脾淋巴细胞增殖活性和ELISA法测LPS诱导的脾淋巴细胞分泌IgG水平,以检测APS特异性免疫;用吞噬中性红法测腹腔巨噬细胞吞噬功能和乳酸脱氢酶测定法测脾NK细胞活性,来检测APS的非特异性免疫。从而筛选出APS中免疫活性最强的组分。(3)将制备出的三种不同分子量的APS体内作用于环磷酰胺免疫抑制小鼠模型,测定血常规、脾脏指数及对特异性免疫和非特异性免疫功能的影响,来评估不同分子量黄芪多糖的免疫调节活性,筛选出APS中免疫活性最强的组分。(4)本研究采用采用高效凝胶过滤色谱法建立不同黄芪药材的多糖特征图谱,基于部分酸水解的HILIC特征图谱分析法建立不同黄芪药材的寡糖特征图谱,以及通过总多糖的酸降解方法,结合柱前衍生化,采用HPLC-UV建立不同黄芪药材的单糖特征图谱。找出不同产地及种植方式蒙古黄芪的相似性和差异性,并通过小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红试验比较三种蒙古黄芪中APS的免疫调节活性以及每种APS水解产物与总多糖之间的免疫调节活性。结果:1.本研究中提取的黄芪多糖总多糖含量为74.6%,蛋白质含量为0.42%,分子量分布情况为300 Da~2 MDa,测得其单糖组成为鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖,它们的物质的量比为0.43:0.23:19.36:0.69:1。采用超滤截留法将APS分为三个部分,即APS-I(2 MDa),APS-II(约10 kDa)和APS-Ⅲ(约300 Da)。并比较了APS中三个不同分子量组分的单糖组成和连接信息,发现三者之间的结构差异。它们虽然具有相同的单糖组成,但是每种单糖的物质的量比不同。在APS-I中Rha,Gal A,Gal,Glu,Ara的比例约为0.1:0.39:13.4:17.2:1;在APS-II中约为0.14:0.14:9.6:24.04:1;在APS-Ⅲ中约为0.375:0.375:18.8:90.5:1。由IR确定它们具有相似的官能团。甲基化和NMR分析显示三者单糖残基的连接位点不同:APS-1单糖残基连接方式为β-L-Ara-(1→,→2)-α-D-Gal-(1→,→4)-α-L-Rha-(1→,→6)-α-D-Glu-(1→,→6)-β-D-Gal-(1→,→4)-α-D-Glu-(1→。APS-II单糖残基连接方式为→2,3)-α-L-Rha-(1→,→5)-α-L-Ara-(1→,→3,4)-β-D-Gal-(1→,→6)-β-D-Gal-(1→,→4)-α-D-Glu-(1→,→3,5)-β-D-Glu-(1→。APS-Ⅲ单糖残基连接方式为→5)-α-L-Ara-(1→,→6)-β-D-Gal-(1→,→4)-α-D-Glu-(1→。2.将制备出的三种不同分子量的APS通过体外作用于小鼠免疫细胞,结果表明:不同分子量的APS都能通过不同程度地增强小鼠脾淋巴细胞增殖活性和脾淋巴细胞分泌IgG水平,来增强APS特异性免疫;通过增强腹腔巨噬细胞吞噬功能和脾NK细胞活性,来增强APS的非特异性免疫。并且最终筛选出APS免疫活性的主要贡献者是APS-II(约10 kDa)。这表明,APS的生物活性与其相对分子质量有关。3.将制备出的三种不同分子量的APS通过体内作用于环磷酰胺诱导地免疫低下小鼠来筛选活性多糖,结果表明,APS-II对改善环磷酰胺免疫抑制小鼠的体重和免疫器官重量具有最明显的作用。增加其特异性和非特异性免疫力的能力最强。这与体外免疫细胞活性筛选实验的结果相互验证,更有利地证明了APS免疫活性的主要贡献者是APS-II(约10 kDa),表明APS的相对分子质量对生物活性有显著影响,除单糖或双糖外,低分子量的APS比高分子量的APS具有更好的免疫调节作用。4.通过对36批黄芪多糖、寡糖和单糖糖谱地分析,结果表明山西浑源仿野生黄芪多糖含量和增强巨噬细胞吞噬活性的能力较高于移栽芪,且黄芪多糖的部分酸水解产物增强巨噬细胞吞噬活性的能力较高于未水解的总黄芪多糖。山西浑源、山西五寨和甘肃陇西的黄芪多糖具有相似的分子量分布,但每个部分的峰面积占总峰面积的百分比具有明显差异,山西黄芪多糖中分子量为10 kDa左右的部分高于甘肃黄芪,PCA显示可以将山西黄芪和甘肃黄芪区分开。从寡糖图谱可以看出,同种APS的部分酸水解产物之间的相似性很高,三种不同APS部分酸水解产物之间差异较大,主要差异在于不同聚合度(DP)寡糖的种类及相对比例。通过建立HILIC-MS法来对特征性寡糖片段进行分析表征,结果表明,三种不同的黄芪多糖均主要为1→4连接的线性葡聚糖,水解后得到DP 3~8的葡寡糖。从单糖图谱可以看出,三者都是由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸5种单糖组成的。但3个产地的APS具有不同的单糖物质的量比。PCA显示可以将3种不同的蒙古黄芪区分开。结论:本论文分析比较了APS中不同分子量的三个多糖组分之间的结构差异。并通过体内体外免疫活性筛选实验找出APS中最具免疫活性的片段。为进一步研究具有不同结构的APS与免疫活性之间的关系奠定了基础,以及为进一步开发APS产品提供了指导。还采用将糖谱技术与APS对细胞免疫功能的影响相结合的方法为不同产地及不同种植方式黄芪的品质评价及质量控制提供了依据。


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