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芝麻粕多肽延长秀丽隐杆线虫健康寿命的分子机制研究

马晓丽  
【摘要】:当前,随着生活水平的日益提高,人们对健康长寿的期望值逐渐升高。许多研究表明,人体衰老主要由于体内自由基失衡所致,从而导致体内代谢紊乱,多种疾病发生。抗氧化剂可以清除体内过多的自由基,减少毒性物质对机体的侵袭,延缓人体的衰老。寻找和开发天然、高效、易得的抗氧化剂一直是生物和食品领域的研究热点和亟待解决的问题。利用农业副产物制备活性多肽不仅成本低,安全性好,而且所获得的活性多肽大多具有明显的抗氧化、抗衰老作用,是当前研究的首选材料。芝麻(Sesamum indicum Linn.)是我国四大油料作物之一,每年约有80%的芝麻用于榨取芝麻油,其副产物芝麻粕的年产量高达50万吨以上。虽然其含有丰富的营养物质和生物活性成分,但目前芝麻粕主要用作农业肥料或者饲料,大大降低了其农业附加值。为了增加芝麻粕的生物利用度,课题组利用缓冲液浸提,硫酸铵沉淀以及凝胶过滤层析的方法制备得到一类活性芝麻粕多肽(Peptides from sesame cake,PSC)。采用Q-Exactive LC-MS/MS的方法鉴定了PSC的多肽序列。体外抗氧化实验表明PSC具有良好的抗氧化活性。为了深入探讨PSC的体内抗氧化应激和延缓衰老效应,本研究选用衰老研究中经典的模式生物--秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans),研究了PSC对秀丽线虫健康寿命的影响及分子机制。主要研究结果如下:1、PSC对C.elegans寿命及衰老相关参数的影响采用体视显微镜观察的方法研究了正常培养条件下PSC对野生型(N2)C.elegans生存率的影响,结果表明在3.125-12.5μg/mL范围内,PSC可剂量依赖性地延长C.elegans的平均寿命,然而当PSC浓度超过12.5μg/mL时,PSC的延寿幅度有所下降。由于衰老是一个复杂的生理过程,单用寿命一个指标不足以描述此过程。因此,选用了三个与秀丽线虫健康相关的参数(咽抽速率、运动能力和体内褐脂质积累水平),结果表明PSC可显著提高C.elegans的咽抽速率和运动能力,并下调了线虫体内褐脂质积累水平。2、PSC延长C.elegans寿命的分子机制秀丽线虫的寿命往往与应激抵抗能力成正相关。利用240μM胡桃醌诱导了氧化应激条件,实验发现PSC可提高应激条件下C.elegans的生存率约38.9%,亦延长了氧化应激敏感型线虫mev-1突变体的寿命。酶活检测实验表明PSC可升高秀丽线虫体内抗氧化酶的活性。随后采用DCF-DA荧光探针的方法检测显示,PSC降低了秀丽线虫内源性活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的积累,表明PSC通过升高抗氧化酶活性降低ROS的水平,从而提高了C.elegans应激抵抗能力,延长了其寿命。接下来探究了PSC延寿的具体分子途径。为了探究PSC的延寿效应是否来自于其氨基酸,利用完全水解后的PSC喂食线虫,结果显示水解的PSC不能引起线虫寿命改变,表明PSC的延寿效应不依赖于其氨基酸。饮食限制是一种保守的延寿效应机制,为了探究饮食限制是否参与了PSC介导的延寿效应,对线虫食物摄取量和饮食限制相关的两个关键因子eat-2和sir-2.1突变体寿命进行了分析。结果显示,PSC对线虫食物摄取量和两种突变体寿命无明显影响,表明PSC的延寿效应独立于饮食限制。qRT-PCR实验和核转位实验结果表明PSC对线虫发挥的有益效应依赖于应激相关转录因子Nrf-2/SKN-1,独立于FOXO/DAF-16和HSF-1转录因子。突变体寿命实验结果进一步说明Nrf-2/SKN-1转录因子在PSC的延寿效应中的作用。在秀丽线虫中调控Nrf-2/SKN-1转录因子的上游信号通路主要为胰岛素/类胰岛素生长因子信号(insulin/insulin-like growth factors-1signal,IIS)通路和p38促有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,本研究检测了IIS通路中daf-2突变体和p38 MAPK信号通路中tir-1,nsy-1,sek-1和pmk-1突变体寿命,结果显示p38 MAPK信号通路对于PSC的延寿效应是必需的。突变体qRT-PCR实验进一步证实,PSC激活的Nrf-2/SKN-1转录因子依赖于p38 MAPK信号通路。在秀丽线虫中,Nrf-2/SKN-1转录因子主要以ASI神经元细胞的SKN-1b亚型和肠道细胞中的SKN-1c亚型两种方式表达。本研究采用了两种SKN-1带荧光标签的线虫品系,研究了PSC激活SKN-1的组织特异性,结果显示PSC显著升高了SKN-1c的核转位。且PSC可升高PMK-1的表达。本研究成功构建了pmk-1RNA干扰菌。当pmk-1 RNAi时,PSC引起SKN-1c的核转位效应丧失。VP303(RNAi仅在肠道起作用的线虫)寿命实验结果显示,当肠道特异性干扰pmk-1和skn-1后,PSC的延寿效应丧失,进一步证实PSC的延寿效应需要肠道特异性的SKN-1c和PMK-1。表明PSC通过激活肠道特异的p38 MAPK信号通路,致使SKN-1c发生核转位,进而激活抗氧化酶系统,降低线虫体内活性氧水平,从而升高了秀丽线虫应激抵抗能力,延长了其寿命。3、PSC对神经退行性疾病的影响及分子机制人类健康寿命的延长主要包括功能健全生存期的延长和患病期缩短。衰老过程常伴随着老年性疾病的发生,这些疾病包括神经退行性疾病,肿瘤,心血管疾病和II型糖尿病等。本研究以最常见的几种神经退行性疾病为靶标,探究了PSC对疾病模型秀丽线虫表型的影响及分子机制。阿尔兹海默综合症(Alzheimer’s disease,AD)是一种与衰老密切相关的神经退行性疾病,也是最常见的老年痴呆症。其确切病因目前尚不明了。普遍认为β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)引起的毒性和氧化应激是其根本原因。本研究采用了两种Aβ转基因AD模型C.elegans,分别为Aβ表达于体壁肌肉细胞的CL4176线虫和Aβ表达于神经元细胞的CL2355线虫,研究了PSC对Aβ诱导毒性的影响及其分子机制。寿命实验和运动能力实验结果显示,PSC可延长CL4176线虫寿命,并提高了其运动能力。僵化分析实验和化学趋向性实验结果表明PSC降低了Aβ诱导的僵化表型速率,并改善了化学趋向性紊乱。免疫印迹、免疫荧光和硫黄素染色实验表明PSC降低了Aβ聚体的积累。硫黄素S动力学实验和原子力显微镜结果表明,体外条件下PSC可促进Aβ的聚集,表明在体内条件下PSC和Aβ之间的作用可能是间接的。蛋白酶体活性和自噬溶酶体检测实验表明,PSC可能通过升高蛋白酶体的活性降低Aβ的积累。PSC如何激活蛋白酶体途径需要进一步探索。由于ROS水平与Aβ积累之间相互促进,研究表明PSC降低了CL4176线虫ROS水平的积累,升高了抗氧化酶基因的表达。RNA干扰实验结果表明,PSC介导的降低Aβ毒性的效应依赖于转录因子Nrf-2/SKN-1。帕金森综合症(Parkinson’s disease,PD)是第二常见的神经退行性疾病。其病理特征为大脑中路易小体的形成和多巴胺神经元紊乱。路易小体主要表现为α突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)的聚集。为了研究PSC对PD相关病理的影响,本研究选用了两种转基因PD模型C.elegans,分别为肌肉细胞表达α-syn::YFP融合蛋白的NL5901线虫和多巴胺能神经元细胞融合表达GFP的BZ555线虫。寿命实验和运动能力实验结果表明PSC可促进NL5901线虫长寿,并提高其运动能力。荧光显微镜检测实验结果表明PSC不仅降低了α-syn积累,而且降低了MPP~+诱导的多巴胺神经元退行及食物感知行为紊乱。机制实验结果表明转录因子Nrf-2/SKN-1对于PSC发挥有益PD的效应是必需的。亨廷顿综合症(Huntington’s disease,HD)也是一种典型的神经退行性疾病,其病理特征为存在重复扩展的谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)束,polyQ异常聚集,诱导细胞毒性,从而引起神经细胞死亡。为研究PSC对polyQ诱导毒性的影响,本研究采用两种polyQ转基因C.elegans,分别为体壁肌肉细胞融合表达polyQ35::YFP的AM140线虫和ASH神经元细胞中融合表达polyQ115::GFP的HA759线虫。寿命实验和运动能力实验结果显示PSC延长了两种线虫的寿命,升高了其身体弯曲指数。僵化实验结果表明PSC降低了polyQ诱导的运动行为紊乱。激光共聚焦显微镜观察实验结果表明PSC降低了polyQ的聚集和诱导的ASH神经元坏死及化学趋向行为失调。此外,PSC提高了AM140线虫氧化应激抵抗能力和抗氧化酶活性,降低了脂质过氧化产物MDA的含量。JC-1荧光探针和萤光素酶实验结果说明PSC改善了线粒体功能参数,包括线粒体膜电位和ATP生成量。RNA干扰实验结果表明PSC降低polyQ诱导的氧化应激和僵化表型依赖于转录因子Nrf-2/SKN-1。综上所述,本研究表明PSC可通过肠道特异性p38 MAPK-SKN-1c通路延长秀丽线虫健康寿命,降低衰老相关神经退行性疾病标志蛋白的聚集及其诱导的毒性,表明PSC可作为功能因子来改善和预防衰老及衰老相关疾病发生发展过程中的氧化应激并发症。本项目的开展丰富了生物活性物质在衰老干预领域的应用,并为农业副产物经济价值的提高和PSC的功能开发提供重要的理论基础。


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