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定点突变对八肋游仆虫中心蛋白功能及性质的影响

赵亚琴  
【摘要】: 中心蛋白是一广泛存在于多种生物体内的蛋白,它属于结合钙离子的EF-hand超家族成员。最初,它是在一种绿藻Chlamydomonas reinhardtii中发现的。而且相关研究表明它主要定位在微管组织中心上,是微管组织进行正常的复制、分裂的一种必需成分。中心蛋白的结构类似于钙调蛋白、肌钙蛋白C的结构,含有四个EF-hand(helix-loop-helix)结构,即四个钙结合位点。随着生物技术的逐步成熟,定点突变成为了科研人员进行科学研究的有力手段。 本文利用生物技术对八肋游仆虫中心蛋白进行了定点突变,获得较纯的蛋白,并且应用光谱手段研究了其部分性质。利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术对八肋游仆虫中心蛋白的451位的苷氨酸进行了定点突变,获得了其重组质粒M-pGEX-6P-M-Centrin,并将其转入大肠杆菌(E.coli)BL21中用IPTG诱导,获得了M-Centrin的可溶性融合表达。融合蛋白GST- M-Centrin菌体经过超声波裂解后得到的上清夜经过GST亲和层析后用PreScission Protease(PPase)酶切,酶切产物再次经过GST亲和层析和HitrapQ阴离子交换层析两步柱层析纯化后,得到纯度较高的的M-Centrin。 利用紫外光谱和荧光光谱的方法探讨了中心蛋白突变体和金属离子及蜂毒素之间的相互作用。实验表明:从紫外吸收图谱看,突变之后的中心蛋白中除了苯丙氨酸的精细结构外还有酪氨酸和色氨酸的吸收峰。蛋白的最大荧光发射峰从310nm红移至360nm。Tb~(3+)和中心蛋白结合优先占据第Ⅲ、Ⅳ位点,形成2:1的稳定配合物。而且,我们从中求得了Tb~(3+)和中心蛋白配合物的条件稳定常数。Tb~(3+)、Ca~(2+)不会影响蜂毒素与中心蛋白的结合。


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