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乙酰胆碱酯酶抑制剂的合成、表征及其对电鳗AChE抑制活性的研究

李妙鱼  
【摘要】: 老年性痴呆(简称AD,1907年由Alois Alzheimer医生发现)为中枢神经系统的一种退行性病变。AD病人的认知功能明显减退,且伴有严重的行为异常,如:易怒、焦虑、沮丧、不辩方向、不安等。AD是一种渐次性疾病,即病人在患病初期症状较轻微,慢慢地各种症状会越来越严重,直至丧失处理日常行为的能力。 乙酰胆碱酯酶(AChE)是与突触体相关联的一种蛋白酶,可促进神经递质乙酰胆碱(ACh)在胆碱能突触体中水解并释放出胆碱,正因此,乙酰胆碱酯酶已成为设计与机理相关的抑制剂的目标酶。近年来,基于“胆碱能假说”,人们将大量的研究集中于寻找高效的、有选择性的AChE抑制剂,从而提高中枢神经系统中蝇碱受体和尼古丁受体处的乙酰胆碱水平。在最初寻找具有强生物活性的AChE抑制剂过程中,人们将精力集中在氨基哒嗪化合物minaprine上。Minaprine不仅表现出抗沮丧的特点且具有类胆碱的功能,鼠体内给药(30mg/kg)后,可明显增加海马(38%)和纹状体(60%)的乙酰胆碱,体外实验表明,对均化的鼠纹状体而言,minaprine是一种作用较弱的可逆竞争性AChE抑制剂(IC_(50)=85uM),对电鳗AChE的抑制作用更弱(IC_(50)=600uM),但对蝇碱M1受体却具有高选择性(IC_(50)=17uM),这促使我们围绕此物质寻找效能更好的AChE抑制剂。 就此目的我们做了大量的研究,现将本文所做的主要工作概括如下: 1.我们以化合物minaprine中的哒嗪环为主要结构单元,并用联苯胺取代其3位上的氨基,从而合成了四种新型的3-联苯氨基哒嗪化合物:3-联苯氨基6-苯基哒嗪(a)、3-联苯氨基-5-甲基-6-苯基哒嗪(b)、3-联苯氨基-6(4-氯苯基)哒嗪(c)和3-联苯氨基-6(4-甲氧基苯基)哒嗪(d)。随后,我们用元素分析、~1H核磁共振谱以及红外光谱对所合成的四种物质进行了表征。结果表明,前三种物质(a、b、c)与预计物相同,但第四种物质(d)的元素分析结果与理论值相差甚远(C、N>>0.5%),可能是由于放置时间过长而分解所致。更可喜的是,我们得到了3-联苯氨基-6(4-氯苯基)哒嗪化合物的单晶,这对我们确定该类衍生物的主体结构提供了可靠的依据。 2.同时,我们还预计用4-(2-氨乙基)-1-苄基哌啶取代哒嗪环上的3位氢。从而得到另一类新型的AChE抑制剂。在合成的过程中,可能由于步骤繁琐而未能成功。但我们却在合成4-(2-氨乙基)-1-苄基哌啶的过程中,意外地得到了(1-苄基哌啶-4-某亚基)乙腈的单晶,通过晶体解析确定了其具体结构,这为我们以后工作的进一步开展打下了基础。 3.我们用传统的Ellman分光光度法,以乙酰硫代胆碱碘化物为底物,5,5-二硫-联(2- 山西大学2004届硕士研究生学位论文 硝基苯甲酸)(DTNB)为显色剂,研究了电鳗AChE的活性。实验中,我们考察了缓冲液 不同的pH值和不同的酶浓度对AchE活性的影响。结果发现:①随着pH值的增加,酶活 性在增加,考虑到生理条件,决定取pH=7.20的缓冲液作为以后研究的基准。②随着酶浓 度的增加,酶活性也在增加。然后我们以反应的初速度对酶总量作图,得酶浓度曲线。从 曲线的走势看,最后决定以0一3min的速度作为酶反应的初速度,并且选定酶总量0 .04Units 作为研究加入抑制剂后对酶活性影响的基准。 4.在上述选定的工作条件下,我们研究了37℃下所合成的三种3一联苯氨基哒啧化合物做 酶抑制剂时,对电鳗AchE活性的影响情况,以抑制%一109【抑制剂l作图,从而求出了它们 抑制AChE的ICS。值.a、b、e三种物质的ICS。值分别为1 .4296 uM、0.5832 uM、0.2998 uM。 与minaPrine抑制电鳗AChE所得的ICS。值(600uM)相比,可以看出:我们所合成的三种 新型的抑制剂,对电鳗AChE的抑制作用要强得多。比较a、b、c三种物质的ICS。值,我 们还可得出如下结论:①当哒嚓环上5位有甲基取代基时要比没有时抑制作用强;②哒嚓 环上6位取代基苯环上的4位被氮原子取代后,抑制作用要强得多。由此我们推断:哒嗦 环以及哒嚓环上的3位和6位可能分别与AChE的活性位点作用,从而降低AChE的活性。 5.我们通过所合成的三种抑制剂对电鳗AChE抑制作用的动力学分析,以及 Lineweaver一Burk作图,得到了它们抑制电鳗AChE的类型:部分非竟争性可逆抑制。并且 由图中直线与纵轴和横轴的截距,我们还可以分别求出上述几种抑制剂的最大表观反应速 度vmaxaPp和表观米氏常数KmaPp。


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