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一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性

李晨  
【摘要】:蛋白酶抑制剂(Proteinase inhibitor,PI)是一类对蛋白酶活性有抑制作用的蛋白质。这类蛋白质普遍存在于动物、植物和微生物中,是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一。根据它们作用于酶的类型,分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中,因丝氨酸蛋白酶抑制剂分布广泛,种类繁多,在蛋白质一级结构、作用机理、氨基酸组成以及生物活性等方面有较为深入的研究。胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor,TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性的一类物质,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。TI分子量一般比较小,作用机制清楚,是研究蛋白质构效关系的合适材料。人们对来自大豆、豇豆、水稻、马铃薯等植物中的胰蛋白酶抑制剂研究得较为广泛,对荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat Tryspin inhibitor,BTI)的研究则比较少。 荞麦(Fagopyrum esculentum Moench.)在世界上一些国家和高寒地区都有种植,在某些地区还被作为主要粮食作物。由于其风味独特,籽实中的蛋白质含量高,含有多种氨基酸,营养丰富,尤其是保健和药用功能显著,日益受到人们的关注。但也有报道表明荞麦食品在人体和动物中不易吸收,较难消化。对其内在成分分析发现,蛋白酶抑制剂作为一种抗营养因子,可以抑制蛋白酶的活性,从而限制了体内氨基酸的正常吸收和利用。另外在体外研究发现,苦荞胰蛋白酶抑制剂能够显著抑制HL-60白血病细胞的增殖,而对正常细胞毒性较小。由以上研究可以发现,BTI是一种重要的有功能的活性蛋白,进一步研究其理化性质非常重要。 我们先前的研究表明养麦籽实中的TI含量较少,经分离纯化后的产量难以满足研究及应用。为了开展BTI的系统研究并揭示其作用的机理,本实验将已构建的重组质粒pQE31-BTI在大肠杆菌M15中大量表达,获得了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(Recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI)。经过亲和层析和凝胶过滤层析纯化得到高纯度的rBTI。通过理化性质分析表明,重组荞麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的性质类似。用MALDI-TOF-MS分析测出rBTI的相对分子质量为9322.1


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