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枣花分生组织特异基因的克隆与表达分析

孙海峰  
【摘要】: 枣树(Zizyphus jujube.Mill)原产于我国,是一种重要的经济林树种,枣果不仅可以食用,还具有一定的药用价值。与其它木本果树不同的是枣树童期相对较短,嫁接苗在嫁接当年即可开花坐果,实生苗大约在生长三年后进入成年期。此外,枣树结果枝是脱落性的,簇生于结果母枝上,其花芽分化与结果枝生长同时进行,在一个生长季节完成花芽分化到果实成熟的整个过程。枣花分生组织特异基因的克隆对揭示枣树独特的花发育特征,了解成年枣树营养生长与生殖生长分子调控机理具有重要意义。 早在上世纪60年代,曲泽州等学者以“婆枣”为研究材料,研究了枣花芽分化的形态学特征,指出枣花芽分化与结果枝生长同时进行的花发育特征,同时描述了枣花芽分化的形态学特征。几乎同一时期,李中涛报道了枣芽的构造和发育特性,指出脱落性结果枝原基由副芽发育而来。这些形态解剖学特征的观察,对于深入研究枣发育具有重要意义。但是有关研究均未涉及结果枝萌发早期分化特征与花发育之间的关系。本论文以山西广栽品种“壶瓶枣”为研究材料,采用细胞学、分子生物学等研究手段,了解成年枣树营养生长(即结果枝分化、生长)与生殖生长(即花芽分化)之间的关系,筛选获得适合于研究枣营养生长与繁殖发育相关基因表达用管家基因,并成功克隆获得花发育关键基因—花分生组织特异基因FLO/LFY、SQUA/AP1同源基因,通过半定量RT-PCR的方法分析了这两个基因在枣树中的表达。 第一部分:枣结果枝分化、生长与花芽分化特征观察。作者采用细胞学手段观察枣萌动期结果母枝和不同生长阶段结果枝的形态学特征,结果表明:结果枝的分化是在结果母枝萌动期间完成的,花芽分化始于结果枝萌发伸出,生长早期结果枝叶原基和花芽原基的分化同时进行,结果枝叶原基分化主要是在结果枝生长早期完成的,但是结果枝先端始终处于叶原基和花芽分化的状态。同时观察到结果枝茎顶端分生组织在其生命周期中不总是符合植物茎顶端分生组织三层细胞的结构特点,进入花期即将枯萎的先端分生组织具有典型的茎顶端分生组织结构。通过测量结果枝长度的方法,绘制出枣结果枝生长趋势图。发现从结果枝萌发伸出到基部叶腋间花蕾可见这段时间,结果枝(长度小于20 mm)生长较慢,基部叶腋间零级花四轮花器官分化并未完成,所以把该阶段结果枝统称为生长早期结果枝;随后进入快速生长期,叶片展开和节间伸长明显加快;进入花期后,生长变缓,先端开始枯萎脱落,逐渐停止生长,枣树结果枝生长表现出“慢-快-慢”的生长趋势。即通过田间调查发现枣树结果枝是通过先端枯萎脱落的方式停止生长的。通过这一部分的工作,基本阐明了枣结果枝分化、生长与花芽分化之间的关系,初步了解了成年枣树营养与生殖生长的年周期性变化规律。 第二部分:生长早期结果枝cDNA文库构建与分析。形态学观察表明:枣生长早期结果枝叶原基分化和花芽分化尚未完成,营养生长与生殖生长同时进行。为了了解该发育阶段结果枝中的基因表达谱,利用Gateway(?) cDNA文库构建试剂盒构建了枣生长早期结果枝cDNA文库。对构建好的cDNA文库分析结果表明:该文库容量为1.23×10~5,文库重组率为39.9%。cDNA插入子大小介于1,000~2,000 bp的所占比例最多,约占31.15%,其次为500~750 bp的,约占28.07%,>2,000bp的插入子数量最少,约占3.69%。测序获得的407条EST序列中,含有367条一致序列,其中202条可以找到最佳匹配序列,这些序列上的一致序列由248条ESTs序列组成,占有效EST数据的67.57%;77条ESTs与推测的、假想的或功能未知的蛋白质序列有相似性,约占20.98%;没有匹配序列的ESTs有42条,约占11.44%。利用Gene Oncology分类系统对小规模测序获得的EST序列进行功能分类,表明该文库表达基因主要参与了代谢、转运、细胞生长、发育、信号转导和逆境应答等生物学过程,其中参与代谢比例最高,占到了参与生物学过程的功能基因的36.5%,其次为参与信号转导和逆境应答的,其中参与逆境应答的比例为28.31%。分子功能表达谱表明生长早期结果枝基因表达产物具有催化活性、酶活性调控、信号转导、结合、结构分子、翻译调控、转运、马达等功能,其中具有催化活性的数量最多,具有结合功能的次之,文库中含有多个克隆的叶绿素a/b结合蛋白、生长素结合蛋白和GTP结合蛋白。 第三部分:枣结果枝分化、生长与花芽分化基因表达研究用管家基因的筛选。利用cDNA文库ESTs序列,筛选获得四条其它物种常用的管家基因同源基因,分别是ZjEF1(GenBank登录号:EU916202)、ZjCyP(GenBank登录号:EU916203)、ZjUBQ(GenBank登录号:EU916200)和ZjH3(GenBank登录号:EU916201)。此外以cDNA文库为模板,克隆获得肌动蛋白同源基因ZjAT1(GenBank登录号:EU251881)。其中前三个基因编码的蛋白产物主要参与蛋白质的合成、折叠以及降解过程,后两个基因产物主要参与核小体和细胞骨架组成。在相同的模板条件下,通过半定量RT-PCR方法分析了这几个潜在管家基因在枣营养枝与生长早期结果枝、结果枝先端和不同器官中的表达。结果表明ZjEF1、ZjCyP、ZjUBQ和ZjAT1表达不稳定,不适合用作管家基因;而ZjH3表达稳定,适合用作研究成年枣树结果枝分化、生长与花芽分化基因表达用管家基因。该结果也说明对于新研究物种,管家基因的筛选是很必要的。 第四部分:枣花分生组织特异基因FLO/LFY的克隆与表达特征分析。FLO/LFY是花发育的关键调节基因之一,在成花诱导中发挥重要作用,不仅改变茎顶端分生组织的分化命运,还参与花器官特异基因的激活过程。通过比对不同植物FLO/LFY保守核苷酸序列,设计引物,通过反转录RT-PCR的方法从展开初期叶片中克隆获得一长445 bp的cDNA片段,命名为ZjLFY。该基因在核苷酸水平和氨基酸水平上,与多种植物同源物表现出较高的同源性。从构建的FLO/LFY进化树发现,ZjLFY具有独立的次级进化分枝,揭示出ZjLFY较早地从其祖先蛋白分化出来。通过半定量RT-PCR的方法分析了ZjLFY在生生长早期结果枝、结果枝先端、不同生长发育阶段叶片和其它组织中的表达,结果表明ZjLFY在所有检测过的样品中呈组成型表达,说明ZjLFY除了具有调节花发育的保守功能外,表现出不同于其它植物同源基因的表达特征,是成年枣树营养生长与花发育的关键调节基因,广泛地参与结果枝分化、生长与花芽分化等过程。 第五部分:枣花分生组织特异基因SQUA/AP1的克隆与表达特征分析。SQUA/AP1同源基因,不仅起着花分生组织特异基因的作用,还起着花器官特异基因的作用,与萼片、花瓣发育有关。本部分通过反转录RT-PCR和快速扩增cDNA末端(RACE)法从枣萼片组织中克隆获得全长的SQUA/AP1同源基因,命名为ZjAP1(GenBank登录号:EU916199)。ZjAP1的开放阅读框长度为738 bp,编码245个氨基酸,5′-和3′-非编码区均显示出长度多态性。保守结构域分析表明:ZjAP1含有SQUA/AP1类MADS盒蛋白典型的MADS盒和K盒结构域,C′-末端还存在SQUA/AP1蛋白典型的法尼醇化位点—CFAA。氨基酸同源性分析表明ZjAP1与蔷薇科植物同源蛋白同源性最高。半定量RT-PCR分析表明:ZjAP1在生长早期结果枝和随后的先端部分、腋芽、花蕾、花、幼果、根、茎和叶片组织中有表达,在营养枝和快速膨大的果肉和种仁组织中没有检测到ZjAP1的表达,说明ZjAP1参与了枣根、茎、叶和多个生殖器官的发育,但表达谱较ZjLFY窄。


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