游仆虫核糖体蛋白L11的功能研究

【摘要】： 蛋白质合成是细胞内最重要的生命活动之一。在所有活细胞中,核糖体是蛋白质合成所必需的细胞器。真核生物中成熟的核糖体包括79种核糖体蛋白和4种核糖体RNA。核糖体蛋白作为核糖体的主要成分,参与蛋白质的合成。此外,核糖体蛋白还具有独立于它们的蛋白质生物合成之外的功能。 核糖体蛋白L11 (ribosomal protein L11, RPL11)是核糖体60S大亚基的重要组成部分,在进化上是一种高度保守的蛋白质。作为核糖体蛋白,RPL11参与核糖体的组装。研究人员发现真核生物中RPL11还具有通过与HDM2相互作用调节抑癌蛋白p53及直接调节癌蛋白c-Myc活性功能等作用。 本实验室以八肋游仆虫为研究对象。在之前的研究工作中已从八肋游仆虫中克隆获得了EoRPL11基因,本研究对EoRPL11进行了亚细胞定位分析,并检测了过表达EoRPL11对蛋白质合成、细胞增殖、细胞周期等的影响。另外,还克隆了人的HDM2全基因及其一种新的剪接变异体,为今后研究HDM2与RPL11的相互作用奠定基础。研究的主要结果如下： 构建了融合绿色荧光蛋白(GFP)的RPL11重组表达载体pEGFP-N1-EoRPL11,转染细胞后利用RT-PCR及Western blot证明了GFP-EoRPL11表达。转染HEK293T及Hela细胞后通过激光共聚焦显微镜观察发现EoRPL11分布于细胞核中,并集中于核仁上。 为进一步研究EoRPL11在细胞中对蛋白质合成的作用,我们构建了带有Myc标签的EoRPL11的哺乳动物表达载体pCMV-Myc-EoRPL11及pCMV-Myc-GST(对照),转染HEK293T细胞后利用RT-PCR及Western blot证明了EoRPL11及GST均过量表达。HEK293T细胞中共转入0.3μg pRL-TK和0.1μg到0.6μg的pCMV-Myc-GST或pCMV-Myc-EoRPL11的质粒,48 h后裂解细胞测定了其中的海肾荧光素酶活性。结果显示,与共转入pCMV-Myc-GST的荧光素酶活性相比,共转入pCMV-Myc-EoRPL11后,HEK293T细胞内的荧光素酶活性明显下降,并且呈一种剂量依赖性的关系。为了进一步分析RPL11是在转录还是翻译过程影响蛋白质合成,我们提取了不同DNA浓度样品的总RNA, Histone为内参,Real time PCR检测荧光素酶的mRNA含量,结果表明荧光素酶的mRNA含量没有明显改变,这说明EoRPL11可能是在翻译水平上抑制细胞内总蛋白质的合成。 本研究还检测了EoRPL11的过表达对HEK293T细胞增殖及周期的影响。利用MTT比色法检测]EoRPL11的过表达对HEK293T细胞增殖率的影响,结果显示,与转入空载体pCMV-Myc的细胞相比,转入pCMV-Myc-EoRPL11的细胞的增殖速率较低,这表明EoRPL11的过表达对细胞的增殖有一定的抑制作用。我们还通过PI染色,流式细胞仪分析了过表达EoRPL11对HEK293T细胞周期的影响。结果发现与未转染质粒和转染空载体pCMV-Myc的细胞周期中处于G1、G2及S期的细胞比例相比,转染pCMV-Myc-EoRPL11的细胞的细胞周期分布没有显著变化,因此推断EoRPL11的过表达并没有诱导HEK293T细胞产生细胞周期阻滞。 RPL11能够与HDM2相互作用,激活细胞内的p53,从而导致细胞生长阻滞、细胞凋亡。本研究从人宫颈癌Hela细胞中克隆到了野生型的HDM2基因及一种新的剪接变异体。该剪接变异体阅读框由1401 bp组成,预测编码466个氨基酸。与野生型HDM2相比,该变异体氨基酸序列的29-53位缺失,395位丝氨酸突变为苯丙氨酸,407位丝氨酸突变为半胱氨酸,其中缺失段29-53位于HDM2与p53相结合区域的上游部分。这可能影响HDM2与p53的相互作用,与p53的失活及癌细胞的转移相关。