收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

利用基因工程菌HC01固定化细胞制备D-对羟基苯甘氨酸

南晶  
【摘要】: D-型氨基酸在生物界广泛存在并且具有天然氨基酸所不具备的优良性能,在药物合成、饲料、食品等方面有广泛的用途。在D-氨基酸的生产中,海因酶法即利用D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶两种酶连续催化5’-单替代海因从而生成相应的D-氨基酸的方法,由于其低消耗,高产率、高反应速率及温和的反应条件而成为工业生产的首选方法。人们构建不同的基因工程菌以期找到适合工业化生产的菌种,本室已经构建了一株可以同时表达海因酶和水解酶的基因工程菌HC01,前期的工作为下一步实验提供了研究基础。 对一菌两酶工程菌HC01转化底物DL-对羟基苯海因(DL-HPH)的最适条件及其细胞固定化进行了研究,HC01游离细胞转化DL-HPH的最适条件为40℃,pH 7.5。通过对固定化细胞酶活力测定,确定细胞固定化的最优条件为海藻酸钠浓度2.5%,细胞浓度为0.029 g/mL,钙离子浓度为3%。固定化HC01的热稳定性比游离细胞高5℃,二价金属离子Mn2+、Mg2+、Cu2+、Co2+和Ni2+在浓度为0.1 mmol/L时对固定化细胞中D-海因酶(HYD)和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(CAB)两酶的活力无显著影响,Mn2+和Mg2+可分别使游离细胞中CAB活力提高至原来的2.1和2.7倍。固定化细胞重复使用六次后仍然保持80%活力,并且使用十次后小球没有破裂,在4℃贮存半衰期可达到12天,显示了良好的稳定性。 利用以上固定化细胞以对羟基苯海因为底物生产D-对羟基苯甘氨酸,用相当于1L菌体活力的固定化细胞转化1L 30g/L的底物,在氮气保护下,当初始pH为9.0,转化温度为40℃,转速为80 r/min,36小时后转化率可达97%左右,反应液经离心,上清液旋转蒸发后,用1N HCL酒精重新溶解,过滤后调pH至7.0即可结晶得到D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG),再用95%乙醇洗涤后烘干可得到了光学纯度为99.7%的D-HPG且得率为85%。利用高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)、傅里叶红外光谱(FT-IR)对所制备的产物进行了表征分析,确定其为D-HPG。 外源基因在大肠杆菌中由于过度表达而易形成包涵体,利用油体蛋白的特性可以对酶进行一步复性、纯化和固定化。本文将油体蛋白基因融合到海因酶基因的C端,将该融合基因分别克隆到pQE30、pET-3a和pET-28a表达载体中,然后转入大肠杆菌感受态细胞诱导表达,在pET28a-hydole/BL21中得到了大量表达的融合蛋白,SDS-PAGE分析主要以包涵体的形式存在,制作人工油体后未检测到酶活性,可能是制作人工油体的条件不适合海因酶复性,仍需进一步探索人工油体的制备条件。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 吕萍萍,王慧,施汉昌,陈国强;基因工程菌强化芳香化合物的处理工艺[J];中国环境科学;2003年01期
2 孙进,吴梧桐;基因工程菌固定化研究进展[J];药物生物技术;1999年04期
3 马士洪;都绛瑛;曲天明;时国栋;虞星炬;吴汝平;冯一民;杨胜利;;固定化细胞膜反应器生产6-APA的研究[J];生物工程学报;1992年01期
4 刘志伟,郭勇,张晨;培养过程对基因工程菌稳定性的影响[J];微生物学通报;2001年02期
5 王晓平,孔祥铎,陆军,张红缨,张今;α-天冬氨酰二肽酶基因工程菌的固定化及其应用[J];吉林大学自然科学学报;1999年03期
6 郑杨春,邓旭,李清彪,卢英华,何宁,孙道华,彭雅娟;高选择性重组菌在含Hg~(2+)环境中的生长富集Hg~(2+)耦合及其连续处理Hg~(2+)废水[J];厦门大学学报(自然科学版);2005年S1期
7 蒋平;田兴军;;氨基酸的开发与应用[J];生命科学仪器;2006年05期
8 刘斌;;不同培养温度对基因工程菌生长及rhG-CSF表达的差异[J];海峡药学;2007年02期
9 邵学良;刘志伟;;基因工程在食品工业中的应用[J];生物技术通报;2009年07期
10 陈颖;朱月明;张峻;李明春;齐欣;唐柳;;海藻糖合酶基因工程菌诱导表达条件的研究[J];食品工业科技;2009年11期
11 梁颂军;谢水波;王文涛;李仕友;;含重金属抗性基因工程菌的构建与应用[J];铀矿冶;2010年02期
12 李旺;张光勤;;纤维素酶基因工程研究进展[J];生物技术通报;2011年08期
13 周文广,黄日波;构建基因工程菌生产1,3-丙二醇的研究进展[J];广西大学学报(自然科学版);2003年04期
14 谭慧杰;;微生物在城市污水处理系统中的应用前景[J];科技情报开发与经济;2007年18期
15 王连广;;甲胺磷生物降解机理及其降解酶的生物合成技术[J];安徽农业科学;2010年13期
16 魏维;黄鹤;阮林高;杨晟;戈梅;陈代杰;;东方拟无枝酸菌基因工程菌产新糖肽类化合物的发酵条件优化[J];中国抗生素杂志;2010年10期
17 杨林;聂克艳;杨晓容;高红卫;;基因工程技术在环境保护中的应用[J];西南农业学报;2007年05期
18 刘春;杨景亮;李再兴;郭建博;;MBR运行初期对基因工程菌的截留特性研究[J];微生物学通报;2008年06期
19 蔡忠贞;刘宏娟;张建安;刘德华;张富春;;基因工程技术在1,3-丙二醇生产中的应用及研究进展[J];现代化工;2007年S2期
20 陈九武,赵学慧,吴思方;固定化细胞合成酯类载体的研究[J];工业微生物;1997年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李勤;黄建安;李娟;张玥;刘仲华;;γ-谷氨酰转肽酶基因工程菌的构建及其产酶条件的初步研究[A];第六届海峡两岸茶业学术研讨会论文集(摘要)[C];2010年
2 孙福在;唐朝荣;赵廷昌;张新建;;利用冰核基因构建促冻杀虫基因工程菌研究进展[A];中国植物病理学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2002年
3 曲艺林;刘兴汉;赵玮明;;改造的成骨生长肽基因工程菌的构建[A];东北三省生物化学与分子生物学学会2008年学术交流会论文摘要[C];2008年
4 魏敏捷;刘春;王慧;黄霞;;基因工程菌用于高浓度有机废水生物处理工艺研究[A];第十次全国环境微生物学术研讨会论文摘要集[C];2007年
5 吴群;林涛;李霜;何冰芳;;天冬氨酸转氨酶基因工程菌的活力与表达的比较[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
6 李会静;于炜婷;许冠哲;刘袖洞;马小军;;海藻酸钠-壳聚糖凝胶微囊固定化细胞非水相中催化性能[A];中国化学会第28届学术年会第12分会场摘要集[C];2012年
7 周集体;杜翠红;黄丽萍;董晓丽;严滨;;染料生物降解基因工程菌研究进展[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
8 饶贤才;张椿;丛延广;胡福泉;;肽抗生素hPAB-β制备工艺中基因工程菌的改建[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
9 郑杨春;邓旭;李清彪;卢英华;何宁;孙道华;彭雅娟;;高选择性基因工程菌E.coli在含汞环境中的生长富集耦合[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
10 宫长斌;罗颖;李霜;徐虹;何冰芳;;基因工程菌双酶耦合法生产L-Phe的初步研究[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘芳;分解肌酐、尿酸基因工程菌的构建及其功能研究[D];中南大学;2012年
2 罗晖;基因工程菌的构建及制备7-氨基头孢烷酸的研究[D];清华大学;2003年
3 张彦新;高表达尿毒素分解酶基因工程菌的构建及酶活性测定[D];中南大学;2010年
4 黎庶;一株基因工程菌噬菌体(EECP)的分离与鉴定[D];第三军医大学;2008年
5 陈新爱;基因工程菌培养若干重要问题的研究[D];浙江大学;2002年
6 杜翠红;沼泽红假单胞菌RubisCO基因的克隆与表达及其固定二氧化碳特性的研究[D];大连理工大学;2003年
7 刘和;芳香烃化合物的微生物降解及基因工程菌的构建[D];浙江大学;2004年
8 马非;重金属离子吸附材料的制备及性能研究[D];太原理工大学;2012年
9 戴艺民;睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD/CR等基因的表达调控研究[D];福建农林大学;2005年
10 张立辉;复合膜生物反应器地下水脱氮技术研究[D];华东理工大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 南晶;利用基因工程菌HC01固定化细胞制备D-对羟基苯甘氨酸[D];山西大学;2010年
2 陆文渊;茶氨酸生物合成基因工程菌发酵工艺的研究[D];中国农业科学院;2008年
3 刘汉英;酶和细胞的固定化研究[D];山西大学;2005年
4 陈震球;基因工程菌pTrcHis2A-hTNF-α-JM109生产人肿瘤坏死因子α的研究[D];暨南大学;2002年
5 王海宾;多聚羟基烷酸的代谢调控与基因工程菌的构建[D];山西大学;2003年
6 张欣;重组人心肌肌红蛋白基因工程菌的构建及重组蛋白的初步纯化[D];中国协和医科大学;2008年
7 李玉彬;重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因工程菌的构建[D];中国协和医科大学;2007年
8 刘建成;L-精氨酸发酵条件研究[D];石河子大学;2008年
9 田永;碱性木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及重组木聚糖酶的特性[D];山东轻工业学院;2009年
10 胡永飞;cglI基因复合体在构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株中的应用研究[D];辽宁大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 操秀英;新型基因工程菌:“吃”完农药就“自杀”[N];科技日报;2009年
2 记者 周亚光;L-蛋氨酸新技术通过验收[N];中国化工报;2000年
3 主持人:彭电子 中国畜牧报专刊部主任,《东方畜牧周刊》常务副主编;为安全,饲用抗生素前景黯淡[N];中国畜牧报;2002年
4 本报记者 李清理;从实验室到产业化的跨越[N];中国证券报;2000年
5 华文;固定化酵母改善酱油风味[N];中国食品质量报;2004年
6 吴茗;新型特种酶令纺织品改性[N];中国纺织报;2005年
7 何国庆 张灏;基因工程 在酶制剂生产中的应用(上)[N];中国食品报;2009年
8 时报记者 万中伟;麦丹集团:自降身价助行业走出危机[N];福建工商时报;2009年
9 张永攀;广济药业 资金关照 中线守仓[N];证券时报;2003年
10 记者 孙彬;L—蛋氨酸生产技术通过鉴定[N];新华每日电讯;2000年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978