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里氏木霉外切葡聚糖酶Ⅰ基因的克隆和生物信息学分析

赵静  
【摘要】:通过对里氏木霉40932所产的外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和p-葡萄糖苷酶酶活测定结果分析,确定了以外切葡聚糖酶Ⅰ为主要研究对象。通过PCR成功扩增出包含启动子和终止子的基因序列,平端连接到pUC118载体上,克隆测序后进行Blast比对分析,为外切葡聚糖酶Ⅰ基因的进一步研究奠定基础。主要的试验结果如下: 1.里氏木霉在第6天时酶活最高,外切葡聚糖酶最高酶活为160.921U/mL,内切酶最高酶为125.297U/mL,β-葡萄糖苷酶最高酶活为45.525U/mL,滤纸最高酶活为124.715U/mL;其中外切葡聚糖酶最高活力为β-葡萄糖苷酶活力的近4倍。里氏木霉表现了高水平的外切葡聚糖酶活力。 2.PCR扩增外切葡聚糖酶Ⅰ基因时,DNA模板最优添加量为1.0μL; dNTP最适添加量为1.3μL;最佳退火温度67.5℃。 3.pUC118与外切葡聚糖酶Ⅰ比例为1:4时连接效率最高,转化大肠杆菌JM10916℃过夜连接效果好。 4.测序结果表明已经成功地扩增出了里氏木霉包含启动子和终止子的外切葡聚糖酶Ⅰ基因片段。DNA全长3496bp,上游启动子序列1500bp,下游终止子序列600bp,与NCBI中已登录的GL985084里氏木霉外切葡聚糖酶Ⅰ基因序列同源性达99%。含有3个外显子和2个内含子,第一个外显子编码信号肽,接下来2个外显子编码成熟肽。开放阅读框由514个氨基酸组成,推测分子量为57kDa。 5.通过生物信息学分析,里氏木霉外切葡聚糖酶Ⅰ基因有三个蛋白编码区,分别是459bp(1499-1959)编码153个氨基酸、697bp(2028-2724)编码232个氨基酸、276bp(2899-3174)编码92个氨基酸;起始密码子ATG(1499-1501),终止密码子TAA(3172-3174)。在外切葡聚糖酶Ⅰ基因的1366bp处有核心启动子TATA框(GTATATATA),它既是转录结合位点也是转录起始位点。


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