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混菌发酵产纤维素酶的分离纯化及其酶学性质研究

张慧芳  
【摘要】:本文对本实验室筛选保存的黑曲霉D2-1、芽孢杆菌83-7和解脂假丝酵母三株菌混合发酵所产纤维素酶液进行了分离纯化及其酶学性质的研究。分别采用硫酸铵分级沉淀法、凝胶柱层析法、超滤和弱阴离子交换柱层析法,分离纯化得到两种内切葡聚糖苷酶组分。主要结果如下: 1.通过比较硫酸铵饱和度对p-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶盐析效果的影响,最终确定硫酸铵最适饱和度范围20%-60%,且酶液pH为5.0时,盐析得到的蛋白含量最高。 2.采用Sephadex G-100凝胶柱层析研究得到最佳分离纯化条件是:凝胶柱长为70cm,上样量为2mL,转速为22r/min时,分离效果最好;洗脱液以Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液效果最佳,得到以内切葡聚糖苷酶为主的峰2。 3.超滤研究中,通过单因素和中心复合设计试验,确定为酶液pH5.09、离心机转速4567r/min、离心时间32.19min、加样量940.98μL时效果最好,其比活值为6.58。 4.采用DEAE FF离子交换层析分离后,得到两个内切葡聚糖苷酶主峰,内切葡聚糖苷酶1比活力提高了14.41倍,纯化倍数为16.95,回收率为22.72%。而内切葡聚糖苷酶2的比活力提高了14.78倍,纯化倍数为17.38倍,回收率仅为0.13%。 5.经SDS-PAGE电泳得知,这两种内切葡聚糖苷酶组分已达电泳纯,其分子量分别为43KD和38KD。 6.电泳纯内切葡聚糖苷酶的酶学性质研究结果表明:分子量为43KD的酶,最佳作用温度50℃,最佳作用pH5.5,30~50℃范围内酶的稳定性较好,pH4.5-6.0,酶的稳定性较好。Fe2+、Zn2+和Ba2+对该酶有明显的激活作用,K+无明显影响,Mg2+、Ca2+、Na+对该酶活性起部分抑制作用,而Cu2+完全抑制其活性。分子量为38KD的酶,最佳作用温度40℃,最佳作用pH5.0,30~50℃范围内酶的稳定性较好,pH5.0-6.0,酶稳定性较好;Zn2+和Ba2+对该酶有明显的激活作用,Fe2+无明显影响;K+、Mg2+、Cu2+、Na+对该酶均有部分抑制作用。


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