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猴头菇中α-半乳糖苷酶的分离纯化及理化性质研究

叶枫  
【摘要】:采用离子交换色谱和凝胶过滤色谱的方法对猴头菇子实体中的α-半乳糖苷酶进行多步纯化,得到一种57 kDa的单亚基α-半乳糖苷酶,命名为HEG。经过多步纯化,HEG的纯化倍数高达为1251倍,比活为46 U/mg。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析,对内源性肽段序列进行BLAST比对,发现该酶属于GH 27家族。在pH=6.0,反应温度60°C时,酶的活性达到最大。猴头菇α-半乳糖苷酶在酸性范围pH 2.2-7.0和温度范围4-40°C稳定性较好。Zn~(2+)、Fe~(3+)、Ag~+、SDS对该酶有较强的抑制作用。双倒数曲线说明半乳糖和蜜二糖对该酶的抑制类型为混合型抑制。化学修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)通过作用于色氨酸残基而显著降低HEG的活性。该酶对酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶表现出明显抗性。HEG对棉籽糖家族寡糖、瓜尔豆胶和槐豆胶均有水解作用,并且酸性蛋白酶还能协同猴头菇α-半乳糖苷酶促进对棉子糖家族寡糖RFOs的水解。该酶对pNPG、棉子糖和水苏糖的K_m值分别为0.36 mM、40.07 mM和54.71 mM。这些优良特性增加了该酶在食品工业和动物饲料中的应用潜力。由于猴头菇子实体价格较贵,故采用猴头菇液体发酵法诱导合成α-半乳糖苷酶。采用单因素试验选择猴头菇液体发酵产α-半乳糖苷酶的最佳诱导物、最佳碳源、最佳氮源和最优金属离子。而后采用响应面法,优化了猴头菇液体发酵诱导产α-半乳糖苷酶的培养条件,得到猴头菇液体发酵诱导产α-半乳糖苷酶的最佳条件为:豆粕3%、葡萄糖2.3%、蛋白胨1.9%、Mg~(2+)0.3%。响应面优化之后,猴头菇液体发酵液中α-半乳糖苷酶的活性为0.475 U/mL,优化效果明显,比优化之前酶活显著提高了50.3%。本研究为猴头菇液体发酵产α-半乳糖苷酶提供了理论依据。


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