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牛完全体外生产胚胎及胚胎性别鉴定取样方法研究

张建新  
【摘要】:利用哺乳动物卵母细胞成功地进行胚胎体外生产可以为胚胎移植和胚胎研究提供稳定的胚胎来源。胚胎体外生产包括卵母细胞体外成熟、体外受精、孤雌激活、胚胎体外培养和性别鉴定等主要环节,本研究针对影响各个环节的关键因素进行研究,旨在不断完善胚胎体外生产技术。 1 卵母细胞体外成熟(IVM) 本试验研究了不同卵泡大小、不同生殖激素、不同类型血清、大卵泡液及不同成熟时间对牛卵母细胞体外成熟的影响。 结果表明,卵泡大小直接影响其中的卵母细胞体外成熟培养的成熟率,来自直径2~5mm,5~8mm和8~11mm卵泡的卵母细胞体外成熟培养的成熟率分别为40.91%,41.82%和39.09%,显著高于来自直径小于2mm卵泡的卵母细胞成熟率16.36%(P0.01),但是卵泡直径超过8mm的卵泡其卵母细胞经成熟培养后卵母细胞质量偏低。 哺乳动物卵母细胞成熟与卵丘的扩张是在激素诱导下完成的,LH,FSH和17β-E_2是促进卵母细胞成熟的重要激素,为了了解这三种激素的互作效应,进行了三种激素的交叉组合试验,筛选了三种激素的最佳协作浓度,17β-E_2,LH和FSH的协作浓度分别为2.55μg/mL,25.08μg/mL和15.03μg/mL。 血清添加物是卵母细胞体外成熟培养中的一种重要物质,成熟培养液中添加胎牛血清(FBS)和发情牛血清(OCS),卵母细胞的体外成熟率显著高于添加新生牛血清(NCS)的成熟率(48.97%和47.59%比22.76%,P0.01);因此FBS和OCS是牛卵母细胞成熟培养中有效的血清添加物。 无激素与血清存在时,大卵泡液能够明显提高卵母细胞成熟率,成熟液中添加10%和5%的大卵泡液(BFF)卵母细胞成熟率分别为29.63%和16.30%,但成熟率很低;培养液中有激素和血清存在时,大卵泡液对卵母细胞成熟的影响不明显。 卵母细胞合理的成熟时间非常重要,卵母细胞体外成熟培养18h~30h,不同成熟时间卵母细胞成熟率差异不显著(52.27%,54.55%,55.30%,P0.05),但是如果成熟时间超过24h体外成熟的卵母细胞质量变差。 2 卵母细胞体外受精(IVF) 本试验主要研究了不同受精液组分、卵丘-卵母细胞复合体结构和精卵共孵育时间对牛卵母细胞体外受精的影响。


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