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猪O型口蹄疫病毒VP_1基因的原核表达及重组蛋白的反应原性检测

杜宇  
【摘要】:口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)引起偶蹄动物的一种传染病,它严重危害家畜的生产力和畜产品质量,给畜牧业生产和进出口贸易造成较大的经济损失,直接威胁着国际贸易和国家声誉及人类食品卫生,因而受到人们的普遍关注。口蹄疫病毒衣壳由VP_1、VP_2、VP_3、VP_4 4种结构蛋白各60个拷贝组成,其中VP_1蛋白又称1D蛋白,其基因位于基因组的2977-3615位,编码213个氨基酸,VP_1暴露在病毒颗粒的表面,是诱导产生中和抗体的主要成分。 本研究以猪O型FMDV TL-69代毒株为研究对象,参考已发表的VP_1基因序列,设计和合成一对引物V_1和V_2,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到FMDV VP_1约600bp的目的基因,将VP_1基因和pET30a+分别用相同的限制性内切酶BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切后,用T_4DNA酶连接后转到宿主菌TG1中,筛选出阳性PETVP_1重组质粒。经测序表明,VP_1基因定向克隆到表达载体pET30a+中。将VP_1基因与Genkank发表的序列进行同源性比较,证明本研究所用毒株与taiwan和chupei taiwan(NCBI登陆号分别为NC004004、AF026168)同源性最高,可达98%。将PETVP_1重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)plays,确定诱导时间和IPTG诱导剂量,结果表明以终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导4h将重组菌处理后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),可观察到含量高且明显可见的条带,说明结构蛋白VP_1基因在大肠杆菌中能高效表达,且表达的融合蛋白分子量约为35KD,与预期蛋白大小一致。经超声波裂解菌体取沉淀和上清经SDS-PAGE电泳证明表达蛋白以包涵体形式存在,表达的重组蛋白N端具有六个纽氨酸(His)标签,经变性、纯化、复性,进行蛋白印迹(Western-blot)分析和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测,该融合蛋白能被口蹄疫病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性。为进一步研制FMD VP_1基因工程疫苗和FMD诊断试剂盒奠定基础。


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