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慢病毒载体介导hTERT对肝细胞生物学的影响

李文媛  
【摘要】:目的:研究慢病毒介导人端粒酶逆转录酶(h-TERT)基因对人张氏肝细胞(chang liver)生物学特性的影响。 方法:将表达h-TERT基因的重组慢病毒感染人肝细胞,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。采用实时荧光RT-PCR方法检测转染前后chang liver肝细胞的h-TERT-mRNA基因表达水平和运用TRAP-PCR法扩增端粒重复序列以及ELISA检测转染前后chang liver肝细胞的端粒酶活性的变化。通过倒置相差显微镜动态观察转染前后肝细胞形态变化及生长增殖情况。通过MTT法观察转染前后细胞增长变化,运用流式细胞术(FCM)检测转染前后细胞周期。通过全自动生化分析仪测定转染前后细胞培养上清中ALB含量以及用RT-PCR方法检测转染前后细胞培养上清中ALB mRNA的表达。采用过碘酸希夫(periodic acid schiff, PAS)实验进行转染前后细胞糖原染色。 结果:转染后的chang liver肝细胞存在h-TERT基因过表达和端粒酶活性上调。形态学观察发现h-TERT-chang liver均呈椭圆形、纺锤形或多角形,上皮样细胞贴壁生长,与转染前细胞相比无明显差异。细胞生长曲线发现h-TERT-chang liver较chang liver生长速度明显提高,进一步检测细胞周期观察到其G1期细胞数下降,G2/M期和S期的细胞数升高,P I升高,提示h-TERT-chang liver较chang liver增殖能力较强。培养上清生化指标结果表明转染后的肝细胞仍然保持了转染前肝细胞的合成分泌ALB功能,转染前后细胞PAS染色结果表明,转染后的肝细胞仍然保持转染前肝细胞的糖原合成功能。 结论:利用h-TERT基因构建的h-TERT-chang liver肝细胞在体外培养条件下基本维持肝细胞原有形态,存活期显著延长,增殖能力较强;并且具有表达和分泌ALB及合成糖原的功能;为生物人工肝在临床的广泛应用提供了廉价易得且安全可靠的肝细胞源,为肝细胞移植和体外药物筛选建立了新的实验基础和生物学模型。


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