液相微萃取在中药黄酮类成分分析研究及其与蛋白结合参数测定中的应用

【摘要】：目的建立一种快速的样品前处理技术—漂浮有机液滴凝固液相微萃取(SFODLPME)与HPLC结合测定中药样品中8种黄酮类低丰度成分二氢杨梅素、杨梅素、漆黄素、槲皮素、柚皮素、山柰素、异鼠李素和白杨素的含量。揭示了黄酮类化合物富集倍数与浓度及与供相体积之间的关系,定义并阐述了EF_(1μg/mL)及其物理意义,计算了漂浮有机液滴凝固相体积及黄酮类化合物的表观分配系数。 方法对漂浮有机液滴凝固液相微萃取的各参数进行优化,优化后的液相微萃取条件:在5.00 mL供相溶液中,加入40μL正十二醇萃取有机溶剂,在600r/min搅拌速度下,室温微萃取40min。萃取完毕后,静置分层并将萃取玻璃管立即放入-20℃的冰箱中冷冻,6min后正十二醇凝固,取出正十二醇固相于平底小烧杯中,待融化后用电吹风吹干正十二醇,冷却后用50μL甲醇溶解,20μL该溶液进行HPLC分析。色谱条件:采用Eclipse XDB-C_(18)柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为甲醇:乙腈:0.3%磷酸溶液梯度洗脱,流速为1 mL/min和0.8 mL/min梯度洗脱,柱温35℃,在波长300 nm处,测定中药中8种黄酮类有效成分的含量。 结果漂浮有机液滴凝固液相微萃取-HPLC测定二氢杨梅素、杨梅素、漆黄素、槲皮素、柚皮素、山柰素、异鼠李素和白杨素的线性范围为0.01~10.00μg/mL;检出限为1.0~0.01ng/mL;日内精密度RSD6.0%,日间精密度RSD7.0%;中药老鹳草、银杏、槐米和侧柏中分析物的回收率在96.0% ~104.2%。当加入萃取溶剂体积为40μL时,形成的漂浮有机液滴凝固相体积为(52±14)μL;8种黄酮类成分的表观分配系数在44.8~243.9之间。 结论该方法操作简单,富集倍数高,对常规前处理方法难以分析的低丰度微量、痕量黄酮类成分的分析具有重要的意义。 目的以8种黄酮类化合物为模型化合物,讨论和比较了中空纤维两相液相微萃取(2p-HFLPME)和中空纤维三相液相微萃取(3p-HFLPME)的萃取行为差异,并与高效液相色谱(HPLC)结合测定中药中黄酮类有效成分的含量。 方法利用自制的微萃取装置,分别对2p-HFLPME和3p-HFLPME的各参数进行了优化。优化后的2p-HFLPME条件:以MOF503聚偏氟乙烯中空纤维为有机溶剂载体,供相中HCl浓度为10~(-5)mol/L,正己醇为接受相,在1500 r/min搅拌下萃取45 min,萃取结束后,接受相被收集到小烧杯中经电吹风吹干,再用50μL甲醇溶解后进行HPLC分析。3p-HFLPME条件:以MOF503聚偏氟乙烯中空纤维为有机溶剂载体,供相中HCl浓度为0.1mol/L,正己醇为有机相, 10~(-6)mol/L NH_3·H_2O为接受相,在600 r/min搅拌下萃取30min,萃取结束后,萃取液进行HPLC分析。色谱条件:采用Eclipse XDB-C_(18)柱,流动相为乙腈:甲醇: 0.3%磷酸溶液梯度洗脱,流速为1 mL/min和0.8 mL/min梯度洗脱,柱温35℃,在波长300 nm处,测定中药中黄酮类有效成分的含量。 结果2p-HFLPME中二氢杨梅素、杨梅素、漆黄素、槲皮素、柚皮素、山柰素、异鼠李素和白杨素在0.01~10.0μg/mL范围内线性关系良好;检出限为0.01~1.0ng/mL;日内精密度RSD8.0%,日间精密度10.0%;中药老鹳草、银杏、槐米和侧柏中分析物的回收率在95.0% ~101.2%。3p-HFLPME中二氢杨梅素、杨梅素、漆黄素、槲皮素、柚皮素、山柰素、异鼠李素和白杨素在0.5~25.0μg/mL范围内线性关系良好;检出限为1.0~100ng/mL;日内精密度RSD7.0%,日间精密度8.0%;中药老鹳草、银杏、槐米和侧柏中分析物的回收率在94.7% ~99.3%。 结论2p-HFLPME得到的富集倍数比3p-HFLPME高。在分析中药老鹳草、银杏、槐米和侧柏中微量黄酮类化合物的含量时,2p-HFLPME明显优于3p-HFLPME,说明2p-HFLPME更适于分析中药中的微量黄酮类成分。 目的将中空纤维液相微萃取(HFLPME)-高效液相色谱法(HPLC)与Bjerrum法或Scatchard法结合,同时、快速研究了6种黄酮类化合物的蛋白结合率、结合常数和结合位点数;讨论了6种黄酮类化合物同时存在时对蛋白结合的竞争作用;分析了黄酮类化合物蛋白结合率的浓度依赖性。 方法聚偏氟乙烯纤维作为有机溶剂载体,正庚醇作为萃取相,pH为7.4的磷酸盐缓冲样品溶液为供相,搅拌速度900r/min,萃取时间2h。在药物与蛋白结合后,游离药物浓度经HPLC测定,进而计算出药物蛋白结合率,同时结合Bjerrum法和Scatchard法得到药物与牛血清白蛋白的结合常数和结合位点数。 结果二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素、山柰素、异鼠李素和白杨素与BSA结合率分别为:29.3%、56.8%、12.2%、25.7%、25.2%和12.8%;与BSA的结合常数分别为17900、18300、5900、8900、9900、18100;结合位点数分别为1.2、2.8、0.6、1.3、1.1、0.5。6种黄酮类化合物共存时对蛋白结合无竞争作用。蛋白结合率对BSA浓度无依赖性,但是部分黄酮类药物蛋白结合率对药物浓度有一定的依赖性。 结论该方法操作简单、快速,有机溶剂用量少,可用于多种黄酮类化合物共存时,药物与蛋白结合的同时、快速研究。