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葡萄糖神经酰胺合成酶参与肝癌细胞多药耐药的实验研究

田彦璋  
【摘要】:研究背景: 肝细胞性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康和生命,全球约半数的肝癌患者集中在中国。我国每年约有11万人死于肝癌,居恶性肿瘤病死率的第二位。其起病隐匿、早期诊断难,且侵袭性强、复发转移率高,因此预后较差。在肝癌的综合治疗中,化疗是其重要治疗手段之一,但多药耐药的发生常导致化疗失败。 肿瘤多药耐药(MDR)是指一种药物作用于肿瘤使之产生耐药后,该肿瘤对其他结构无关、机制相异的多种抗肿瘤药物也具有耐药性。MDR的形成是肿瘤免受化疗药物攻击的细胞防御机制,也是肿瘤化疗失败的主要原因。 近年来神经酰胺途径在多药耐药中的作用逐渐引起了人们的关注。神经酰胺作为第二信使参与调节细胞的凋亡。细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)是一种葡萄糖基转移酶,参与神经酰胺的代谢,可催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)上的葡萄糖基与神经酰胺结合,使神经酰胺糖基化成无细胞毒性的葡萄糖神经酰胺(GlcCer),从而降低了细胞内神经酰胺的含量,使细胞逃避神经酰胺介导的细胞凋亡作用,导致多药耐药的发生。GlcCer可被一系列糖基转移酶修饰,合成更高形式的鞘糖脂,这些鞘糖脂与肿瘤细胞的生物学行为密切相关,不仅维持着细胞的正常结构功能,还参与细胞增殖、分化、免疫识别和信号转导等,可以对抗药物诱导的细胞凋亡,亦使肿瘤细胞发生多药耐药。 目前,国内外研究者对于GCS参与肿瘤耐药的研究主要集中在乳腺癌、白血病、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤以及表皮样癌等恶性肿瘤,对于其在肝癌细胞多药耐药中作用机制尚无研究报道,GCS参与肿瘤细胞多药耐药的作用机制尚未完全清楚。在多药耐药逆转方面,已发现的一些耐药逆转剂在临床应用中特异性不高、毒副作用严重,其临床应用受到限制;目前的基因治疗也存在特异性不强、效率不高、临床应用困难等缺点。因此,寻找高效、低毒的耐药抑制剂成为目前研究的热点。 研究目的: 本研究旨在通过基因转染技术使肝癌细胞HepG2内GCS高表达,观察细胞耐药性的变化情况,明确GCS是否参与了肝癌的多药耐药;观察高表达GCS基因的细胞株HepG2/GCS内多药耐药基因MDR1的表达情况,明确GCS与MDR1在肝癌多药耐药中是否具有相关性,进一步探讨GCS在肝癌多药耐药中的作用机制;运用黄芪甲苷进行逆转耐药的研究,观察其对肝癌细胞多药耐药的逆转效果,探讨其可能的机制。 研究方法: 1.构建GCS基因的真核表达质粒pEGFP-GCS,应用脂质体转染法将其导入HepG2细胞,经G418筛选后建立稳定表达的肝癌细胞模型HepG2/GCS,以空载体转染细胞HepG2/pEGFP作为阴性对照; 2.应用RT-PCR和WesternBlot法检测基因转染后HepG2细胞内GCS mRNA和GCS蛋白的表达; 3.流式细胞仪检测基因转染后HepG2细胞在5-Fu作用下的凋亡情况; 4.分别应用RT-PCR和WesternBlot法检测HepG2/GCS细胞内MDR1mRNA和P-gp的表达; 5.通过MTT比色法检测HepG2细胞和HepG2/GCS细胞对阿霉素的敏感性,计算IC50; 6.以MTT比色法检测黄芪甲苷的细胞毒性,及其对HepG2/GCS细胞药物敏感性的影响; 7.应用Hoechst 33258染色检测黄芪甲苷联合阿霉素对HepG2/GCS细胞凋亡的影响; 8.Western blot检测黄芪甲苷对细胞GCS蛋白和P-gp表达的影响及黄芪甲苷联合ADM对HepG2/GCS细胞Caspase3表达的影响; 9.使用SPSS13.0软件进行统计分析,实验数据用均数±标准差(x±s)表示,组间均数比较采用t检验,P0.05表示有统计学意义。 结果: 1.成功构建了GCS基因的真核表达质粒pEGFP-GCS,应用脂质体转染法将其导入HepG2细胞,应用G418抗生素筛选出稳定表达的细胞株HepG2/GCS; 2. RT-PCR与WesternBlot结果表明,基因转染细胞HepG2/GCS的GCS mRNA的相对表达量为2.42±0.13,较HepG2/pEGFP细胞0.34±0.02和HepG2细胞0.41±0.03明显增加(P0.05),HepG2/GCS细胞内GCS蛋白表达量为HepG2细胞的4.8倍,差异具有统计学意义(P0.05),证明高表达GCS基因肝癌细胞株HepG2/GCS构建成功; 3.流式细胞仪检测结果表明,经终浓度为200μg/ml的5-Fu作用后,HepG2/GCS细胞的凋亡峰明显低于正常细胞,HepG2/GCS细胞的凋亡率明显低于HepG2/pEGFP细胞和HepG2细胞(P0.05); 4.基因转染细胞株HepG2/GCS的GCS mRNA、MDR1 mRNA表达较HepG2/pEGFP细胞和HepG2细胞均明显增加,差异有统计学意义(P0.05),HepG2/GCS细胞内GCS蛋白和P-gp表达量分别为HepG2细胞的4.8倍、1.55倍,差异具有统计学意义(P0.05); 5.MTT法检测结果显示,阿霉素对HepG2/GCS细胞和HepG2细胞的ICso值分别为(11.6±1.05)μg/ml和I(6.2±0.35)μg/ml,两者比较差异有统计学意义(P0.05),耐药倍数为1.87;其对HepG2/pEGFP细胞和HepG2细胞的作用则无明显差异(P0.05); 6.细胞毒性检测结果显示黄芪甲苷对HepG2/GCS细胞无明显毒性,经终浓度为40μg/ml的黄芪甲苷作用后,HepG2/GCS细胞对阿霉素的敏感性增强,其IC50值为(7.7±0.24)μg/ml,较未作用组HepG2/GCS细胞(11.6±1.05)μg/ml明显降低(P0.05),逆转倍数为1.50; 7. Hoechst 33258染色结果显示:经黄芪甲苷处理后,HepG2/GCS细胞对阿霉素敏感性增强,在阿霉素作用下,HepG2/GCS细胞发生凋亡、坏死,许多细胞脱离贴壁,无法观察到,而残余细胞大部分呈现出典型的凋亡形态; 8. Western blot检测黄芪甲苷对细胞GCS蛋白表达的影响,结果显示经浓度为40μg/ml的黄芪甲苷作用后,HepG2/GCS细胞内GCS蛋白量为1.05±0.09,较作用前1.71±0.2明显下降(P0.05),而细胞内P-gp的表达无明显变化; 9. Western blot检测黄芪甲苷联合ADM对HepG2/GCS细胞Caspase3表达的影响,结果显示:联合使用黄芪甲营和ADM后,HepG2/GCS细胞内Caspase-3的含量上升为1.98±0.13,与单用ADM组1.17±0.15比较有显著差异(P0.05)。结论: 1、高表达GCS可以使肝癌细胞HepG2对化疗药物5一Fu、阿霉素的药物敏感性降低,提示GCS参与介导了肝痛细胞HepG2的多药耐药。 2、在高表达GCS基因的耐药肝癌细胞株HepG2/GCS内,多药耐药相关基因MDR1表达上调,提示在肝癌细胞多药耐药过程中,GCS基因与MDR1基因具有『E相关性,这可能是GCS参与肝癌多药耐药的机制之 3、黄芪甲苷可以提高耐药肝癌细胞株HepG2/GCS对阿霉素的敏感性,其机制可能是下调GCS的表达,激活caspases凋亡级联通路而增强了阿霉素诱导细胞凋亡的作用。实验表明,黄芪甲苷是一个低毒、有效的耐药逆转剂,有望进一步应用于临床研究。


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