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大鼠急性心肌缺血心脏和背根神经节差异蛋白质组学和mRNA研究

樊慧杰  
【摘要】:目的 心肌缺血不是一个独立的病理过程,作为伤害性刺激可以激活伤害性感受器。基于急性心肌缺血可引起背根神经节P物质、降钙素基因相关肽等物质表达改变的前期研究结果,本课题研究急性心肌缺血后心脏和背根神经节的差异蛋白质和mRNA水平,研究去除辣椒素敏感感觉神经(capsaicin sensitive nerves denervation)后心脏和背根神经节的差异蛋白质和mRNA,旨在探讨心肌缺血或去神经对心脏和背根神经节的影响、以及发现心脏和背根神经节之间新的关系点。 方法 选用新生48 h-72 h雄性SD大鼠,注射辣椒素(50mg/kg),制备去辣椒素敏感感觉神经(简称“去神经”)大鼠模型,通过大鼠的甩尾反射潜伏期时间评估模型。选用270g±20g雄性SD大鼠,结扎冠状动脉左前降支,制备急性心肌缺血模型(coronary artery occlusion,CAO),通过观察缺血心肌颜色和心电图评估模型。 大鼠随机分为:正常大鼠假手术3h组(N-Sham3h)、正常大鼠心肌缺血3h组(N-CAO3h)、正常大鼠假手术6h组(N-Sham6h)、正常大鼠心肌缺血6h组(N-CAO6h)、去神经大鼠假手术3h组(D-Sham3h)、去神经大鼠心肌缺血3h组(D-CAO3h)、去神经大鼠假手术6h组(D-Sham6h)、去神经大鼠心肌缺血6h组(D-CAO6h),共计8组,各组3只大鼠。 应用蛋白质组学筛选8组心脏和背根神经节(胸段T1-T5)的差异蛋白质。具体方法是:制备组织的蛋白质样品,依次行等电聚焦电泳、SDS电泳、银染凝胶、双向电泳图谱采集和统计分析、切取差异蛋白质斑点、酶切和肽段提取、HDMS的液相质谱分析。根据差异蛋白质斑点的质谱鉴定结果,Primer Premier 5.0软件设计引物,分别提取8组心脏和背根神经节组织总RNA,鉴定RNA纯度,PCR扩增,Pfaffl法计算目的基因的相对表达量,SPSS13.0统计软件t检验分析。 结果 去神经大鼠模型的甩尾反射潜伏期时间明显延长,有统计学差异(P0.01),说明制备的去神经大鼠模型获得成功。急性心肌缺血模型结扎冠状动脉前降支后心肌缺血区域颜色明显变白,心电图显示ST段抬高,T波变宽大、畸形,符合急性心肌缺血的心电图特征,造模成功。 在心脏筛选出7个蛋白质,鉴定为5种,分别为:Cu-Zn超氧化物岐化酶(SOD1)、晶状体蛋白(Cryab)、谷胱甘肽S-转移酶-P(GST-P)、短链酰基辅酶A脱氢酶(SCAD)、NADP-异柠檬酸脱氢酶(NADP-ICDH)前体。在背根神经节鉴定出5种蛋白质,分别为:GST-P、Cryab、ATP合酶α亚基(Atp5a1)前体、亲环素A(Cyp A)和碳酸酐酶-2(CA2)。 在心脏和背根神经节均鉴定出Cryab。心肌缺血时心脏Cryab蛋白质出现三种形式,分别为(以软件生成的编号来区分):点5105(分子量30 KDa,等电点6.98)、点5106(分子量32.5KDa,等电点7.02)、点5111(分子量30.2 KDa,等电点7.27)。点5106在心脏的8个组别中均有表达;与假手术组相比,点5106在急性心肌缺血时上调。点5105只在N-CAO6h、D-CAO6h中出现,其余组别未见。点5111在N-Sham3h、N-Sham6h、D-Sham3h、D-Sham6h中均未见,但是N-CAO3h、N-CAO6h、D-CAO3h、D-CAO6h中均有表达。 心肌缺血时正常大鼠心脏缺血区域发生明显变化的点有:SOD1的N-CAO6h与N-Sham6h相比较出现显著下调(P0.05);点5106和点5111Cryab的N-CAO3h与N-Sham3h相比较出现显著上调(P0.05),点5105、点5106和点5111Cryab的N-CAO6h与N-Sham6h相比较出现显著上调(P0.05或P0.01);GST-P的N-CAO6h与N-Sham6h相比较出现显著下调(P0.05);SCAD的N-CAO6h与N-Sham6h相比较出现显著上调(P0.05);NADP-ICDH前体的N-CAO6h与N-Sham6h相比较出现显著下调(P0.05)。心肌缺血时正常大鼠背根神经节发生明显变化的点有:Cryab的N-CAO6h与N-Sham6h相比较出现显著下调(P0.05);Atp5a1前体的N-CAO3h与N-Sham3h相比较出现显著下调(P0.05)。心肌缺血时去神经大鼠心脏缺血区域发生明显变化的点有:点5106和点5111Cryab的D-CAO3h与D-Sham3h相比较出现显著上调(P0.05),点5105和点5111Cryab的D-CAO6h与D-Sham6h相比较出现显著上调(P0.05);GST-P的N-CAO3h与N-Sham3h相比较出现显著下调(P0.05);SCAD的N-CAO6h与N-Sham6h相比较出现显著上调(P0.01);NADP-ICDH前体的N-CAO6h与N-Sham6h相比较出现显著下调(P0.05)。心肌缺血时去神经大鼠背根神经节发生明显变化的点有:Cyp A的D-CAO3h与D-Sham3h相比较出现显著上调(P0.05),Cyp A的D-CAO6h与D-Sham6h相比较出现显著上调(P0.05);CA2的D-CAO3h与D-Sham3h相比较出现显著下调(P0.01)。去神经与正常大鼠比较,由于去神经的作用引起心脏蛋白质发生明显变化的有:Cryab和SOD1;由于去神经的作用引起背根神经节蛋白质发生明显变化的有:Atp5a1前体和GST-P。 在正常大鼠和去神经大鼠中,实时荧光定量PCR结果与蛋白质趋势都一致的点有:SOD1和SCAD,它们蛋白质水平主要依靠mRNA来调控。 结论 急性心肌缺血SOD1的降低可能加重超氧化物的聚集;去神经大鼠的SOD1基础水平较低,提示去神经大鼠清除超氧化物的能力降低;心脏SOD1蛋白质水平主要依靠mRNA水平调控;在正常大鼠,感觉神经可能参与调控心脏SOD1。心脏Cryab蛋白质出现了三种形式;心肌缺血时背根神经节的Cryab可能通过轴索到达心脏。心肌缺血致使GST-P降低;心脏缺血对背根神经节的GST-P蛋白质水平无影响。心肌缺血SCAD上调;NADP-ICDH前体下调,消耗的NADP-ICDH前体可能用于产生大量的NADP-ICDH。心肌缺血引起缺血3h背根神经节Atp5a1前体急剧下降,说明其可能用于生成ATP合成酶。 心脏SOD1、Cryab、GST-P、SCAD、NADP-ICDH (mitochondria)前体是大鼠急性心肌缺血时心脏发生变化的蛋白质。DRG的Cryab、Atp5a1前体是大鼠急性心肌缺血时背根神经节发生变化的蛋白质。心脏SOD1和Cryab可能受辣椒素敏感感觉神经对其蛋白水平的调控。辣椒素对感觉神经的作用表现在DRG的Cryab、Atp5a1前体、GST-P、Cyp A、CA2。


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