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急性心肌缺血早期降钙素基因相关肽和神经生长因子的表达

岳维  
【摘要】:研究目的:观察神经生长因子(NGF)、降钙素基因相关肽(CGRP)在大鼠背根神经节(DRG)、脊髓和心脏的分布;检测大鼠冠状动脉结扎后不同时点NGF、CGRP及其mRNA在DRG和心脏的表达变化,以及胸段硬膜外麻醉、NGF受体(TrkA)拮抗剂和乳鼠辣椒素预处理的干预效应。通过分析CGRP和NGF表达变化关系,探讨在心肌缺血神经源性反应中神经肽表达的调节机制。 研究背景:已有的相关研究表明,CGRP等活性物质参与机体对心血管系统功能的调节。在发生急性心肌缺血时,心肌组织内CGRP的含量明显升高,提示CGRP参与并影响急性心肌缺血的病理变化过程,目前关于其合成与释放的调节机制尚不明确,其中NGF是最重要的调节因子。 研究内容及方法: 第一部分:大鼠心脏和背根神经节CGRP、NGF的组织化学研究 实验选用雄性SD大鼠随机分为两组:(1)正常对照组(Normal group),麻醉后直接处死;(2)结扎冠状动脉组(CAO group),单纯扎闭冠状动脉左前降支。每组均为6只动物。采用荧光免疫组织化学和原位分子杂交技术观察结扎冠脉后30min大鼠DRG、脊髓和心脏组织NGF及其受体TrkA、CGRP及其mRNA的表达部位;并应用银染法检测心脏神经组织的分布。 第二部分:急性心肌缺血大鼠心肌组织和背根神经节CGRP、NGF的表达 动物随机分为两组:(1)手术对照组(Sham group),只开胸暴露心脏,不结扎冠脉;(2)结扎冠状动脉组(CAO group)。每组又分15min、30min、1h和6h四个时点(n=6)。通过心电图监测和TTC染色判断心肌缺血模型制备成功;采用ELISA和实时荧光Rt-PCR方法定量检测结扎冠脉后不同时点大鼠胸段DRG和缺血心肌组织NGF、CGRP及其mRNA的表达变化。 第三部分:胸段硬膜外神经阻滞效应的研究 动物随机分为三组:(1)手术对照组(Sham group);(2)结扎冠状动脉组(CAO group);(3)罗哌卡因硬膜外麻醉组(EA group)。每组又分15min、30min、1h和6h四个时点(n=6)。在结扎左冠状动脉前15min经胸段硬膜外给予1%罗哌卡因120μg.kg-1或生理盐水。采用ELISA和实时荧光Rt-PCR方法从蛋白和mRNA水平定量分析胸段硬膜外麻醉对NGF、CGRP及其mRNA表达的干预效应。 第四部分:TrkA受体拮抗剂及辣椒素干预效应的研究 1、动物随机分为三组(n=6):(1)手术对照组(Sham group);(2)结扎冠状动脉组(CAO group);(3)AG879硬膜外给药组(AG879 group)。在结扎左冠状动脉前15min经胸段硬膜外给予AG879(10-7mol/L)或生理盐水。2、动物随机分为四组(n=6):(1)正常大鼠手术对照组(Normal-Sham group);(2)正常大鼠结扎冠状动脉组(Normal-CAO group);(3)去神经大鼠手术对照组(Denervated-Sham group);(4)去神经大鼠结扎冠状动脉组(Denervated-CAO group)。雄性SD乳鼠辣椒素50mg/kg皮下注射制备去感觉神经模型,测定甩尾反射潜伏期和心重/体重百分比鉴定模型成功。采用ELISA和实时荧光Rt-PCR方法从蛋白和mRNA水平定量分析TrkA受体拮抗剂和乳鼠辣椒素预处理对NGF、CGRP及其mRNA表达的干预效应(根据第二部分实验结果,选取CAO后15min进行mRNA扩增,CAO后30min进行蛋白定量)。 结果: 1、HE染色显示心内神经节的完整形态,神经组织银染观察到发达的神经纤维密布于心房肌和心外膜下。 2、CGRP主要分布于脊髓背角浅层、心外膜、心房组织及血管内皮,DRG内CGRP及其mRNA主要表达于中、小直径神经元,心脏CGRP自身合成较弱。 3、在心脏、脊髓和DRG内均有NGF及其受体TrkA的分布,尤其在心脏NGF免疫阳性细胞位于心肌间隙、心外膜、脂肪组织和血管壁外层。 4、在缺血心肌组织和DRG,与相应时点sham组比较,CAO组CGRP蛋白含量明显升高(P0.05);与相应时点sham组比较,CAO组背根神经节β-CGRP mRNA的表达在15min明显降低(P 0.05),而α-CGRP mRNA在6h显著升高(P 0.05)。 5、在缺血心肌组织,与相应时点sham组比较,CAO组NGF蛋白含量显著升高(P0.05),在6h时NGF mRNA的表达明显上调(P 0.05);在DRG,CAO组NGF蛋白含量升高仅在1h时有统计学意义(P0.05),而NGF mRNA的表达随时间延长显著下调(P0.05)。 6、EA能显著抑制CAO诱导的DRG和缺血心肌组织CGRP和NGF蛋白含量的增高(P0.05),在15min时可以部分逆转背根神经节β-CGRP mRNA的下调(P 0.05),并且在6h时显著降低背根神经节CGRP mRNA和NGF mRNA的表达(P 0.05);EA对心脏NGF mRNA有上调趋势(P0.05)。 7、硬膜外给予AG879可以显著降低背根神经节CGRP mRNA的表达(P 0.05),对CGRP蛋白有下调趋势,但无统计学意义(P0.05)。 8、与正常大鼠比较,辣椒素去感觉神经大鼠甩尾反射潜伏期明显延长(P0.01),心重/体重百分比显著降低(P0.05)。辣椒素去感觉神经可以明显降低成年大鼠CGRP及其mRNA的表达(P 0.05),显著升高NGF蛋白含量(P0.05)。 结论: 1、NGF和CGRP在成年大鼠心脏和DRG均有表达,CGRP合成主要来源于神经组织。 2、急性心肌缺血早期,胸段DRG和缺血心肌组织CGRP、NGF的表达均上调,共同参与了急性心肌缺血病理过程。 3、神经冲动参与介导了心肌缺血早期DRG和心肌组织NGF、CGRP的合成和释放。 4、急性心肌缺血早期DRG源性NGF对感觉神经元CGRP的合成具有一定调节作用。 5、辣椒素去感觉神经诱导NGF代偿性大幅度升高,以促进感觉神经修复和再生。


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