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EL-MLPA技术的建立及MLPA/DHPLC在染色体非整倍体诊断中的应用研究

曹美婷  
【摘要】:目的:①研究建立一种检测21号染色体上21-三体综合征(D.S)关键区的短串联重复序列(STR)等位基因拷贝数的方法。②探索21-三体综合征无创产前筛查的可行性。 方法:①以多重连接探针扩增技术(MLPA)为基础,在21号染色体上选择8个在中国人群中杂合度高的STR序列,合成延伸-依赖于多重连接探针扩增技术(EL-MLPA)所用的8对探针。②在同一反应管内同时进行左探针的延伸及其与右探针的连接,即:选出最适宜的DNA聚合酶(AmpliTaq DNA Polymerase,stoffel Fragment)与连接酶(Ampligase,SALSA Ligase-65),并将其联合用于同时进行延伸和连接反应,建立EL-MLPA技术。③人外周血中DNA的提取:本实验采用Qiagene公司的QIAamp DNA Blood MiniKits试剂盒提取DNA,用DHPLC(变性液相高效色谱)仪检测其纯度,并用细胞遗传学染色体核型分析证实其核型。④用EL-MLPA技术对所提取DNA标本中21号染色体上8个STR多态性等位基因进行定量检测。⑤经ABI 3130XL分离、分析,并和染色体核型分析结果进行对比,验证该技术的可行性及稳定性。 结果:用该EL-MLPA技术检测了80例外周血DNA,其中包括50份正常DNA、30份21-三体DNA标本。经ABI 3130XL分离、分析,结果显示:检测正常人DNA所得图谱中,出现1个峰,峰高耸,或出现2个峰,峰高接近;检测21-三体DNA所得图谱中,出现2个峰,其中一个峰高约是另一个峰高的2倍,或出现3个峰,峰高接近。检测结果与染色体核型分析结果一致。 结论:①EL-MLPA技术是检测21号染色体上STR等位基因拷贝数的较好方法。②所建立的EL-MLPA能准确测出靶基因上STR等位基因片段拷贝数0.5-1.0倍的增加或减少,可用于21-三体综合征胎儿的产前筛查。 目的:初步建立运用多重连接探针扩增(MLPA),联合变性液相高效色谱(DHPLC)技术,快速诊断常见染色体非整倍体的方法。 方法:①用QIAamp DNA Blood Mini kits试剂盒提取外周血中DNA,DHPLC(变性液相高效色谱)仪检测其纯度,并用细胞遗传学染色体核型分析证实其核型。②应用SALSA MLPA Kit-P095试剂盒将待测DNA标本进行MLPA反应:杂交—连接—PCR—电泳。③得到的MLPA PCR反应产物用DHPLC仪进行分离分析,并与用ABI 3130XL得到的结果加以对比。 结果:用MLPA技术检测了正常人DNA 10份、21-三体DNA 16份、47,XYY DNA 3份、47,XXX DNA 3份。PCR反应产物用DHPLC仪进行检测,结果显示:与正常人DNA相比,21-三体DNA所得图谱中,代表21号染色体的所有峰均明显增高,比正常人DNA图中对应峰高增加约50%;47,XYY DNA图谱中,代表Y染色体的4个峰增高明显,约为正常人DNA中Y染色体峰高的2倍;47,XXX DNA图中,代表X染色体的8个峰均明显增高。这与用MLPA/ABI 3130XL检测及染色体核型分析结果一致。 结论:用单管MLPA反应产物结合DHPLC即可对常见染色体非整倍体作出快速、准确的诊断。


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