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缺血后处理对缺血/再灌注损伤的修复及修复细胞来源的研究

张旻  
【摘要】:目的: 缺血后处理(Ischemic Postconditioning, IPO)具有减轻缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤的作用。其保护作用的信号传导机制,不仅能阻止细胞凋亡,还参与细胞周期的调控。本课题组已经证明IPO可以诱导心肌细胞增殖特异性指标5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine, BrdU)、磷酸化组蛋白H3(phosph-Histone H3,H3P)、Aurora B的表达增加,初步证明IPO除能减少细胞凋亡外,还可以促进心肌细胞增殖补偿受损的心肌细胞。本研究的目的是明确增殖细胞是来源于正常成熟心肌细胞还是多潜能干细胞。通过检测多潜能干细胞表面特异性标记物c-kit、Gata-4、Mef2C,如果c-kit、Gata-4、Mef2C测定结果阳性,可以确定心肌组织内多潜能干细胞的存在,如果c-kit阳性、Gata-4、Mef2C阴性则为心肌肥大细胞。再通过免疫荧光技术检测心肌横纹肌肌动蛋白(α-sarcomericactin,α-SMA)确定成熟心肌细胞的数量,并与多潜能干细胞的数量进行相关性分析,推测心肌细胞增殖的可能来源。此外,通过五个时间点观察c-kit蛋白的表达量,观察干细胞数量随时间变化的趋势。 方法: 1.分组和模型的建立。雄性SD大鼠,体重250g-300g,分为三个处理组(假手术组、I/R组和IPO组),五个观察时间点(1d、3d、7d、14d、30d)。假手术组(S组):将大鼠开胸左冠动脉下穿线不结扎;缺血/再灌注组(I/R):大鼠开胸结扎左冠状动脉30min,松开结扎线;缺血后处理组(IPO组):大鼠开胸结扎左冠状动脉30min后松开结扎,再灌注10s,再缺血10s,连续三个循环后松开结扎线。 2、心肌细胞增殖指标的观察。采用普通免疫组化SABC法定位观察细胞增殖特异性指标5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine, BrdU)和横纹肌肌动蛋白(α-sarcomericactin, α-SMA),分析心肌细胞DNA合成。 3、增殖细胞来源的证明。c-kit荧光免疫标记法定位观察、western blot检查其含量,RT-PCR分别检测c-kit、Gata-4、Mef2C的表达。荧光免疫标记法观察α-SMA,相关性分析c-kit和α-SMA的阳性细胞数量,确定最终细胞可能来源。 4、通过血流动力学检测,观察IPO对受损大鼠心脏功能的保护作用。 结果: 1、心肌细胞增殖的证明。免疫组化SABC法定位观察BrdU。BrdU位于心肌细胞核,目标蛋白染色呈棕黄色为阳性细胞。结果显示,棕黄色阳性目标蛋白颗粒在心肌组织呈散在分布,假手术组阳性细胞较少,I/R组和IPO组阳性细胞不同程度增多。BrdU在IPO组(PU值为:7.81±1.39);I/R组(PU值为:5.27±1.35);假手术组(PU值为:4.39±1.22)。统计学分析结果显示IPO组的PU值与假手术组比较,有显著性差异(P0.05)。IPO组与I/R组比较、I/R组与假手术组比较均在数值上有提高,但无统计学意义。 2、增殖细胞来源的证明。 2.1c-kit的检测 荧光免疫标记法结果显示,在IPO组看到有c-kit阳性细胞,尤其3天数量较多(PU值为:2.91±0.29、5.39±0.42、4.37±0.35、3.02±0.67、2.14±0.25),差异存在统计学意义(P0.05);I/R组的c-kit阳性细胞集中于7天(PU值为:1.29±0.12、2.64±0.274.71±0.59、2.85±0.27、1.71±0.38),差异存在统计学意义(P0.05),其他处理组几乎没有看到c-kit阳性细胞。 western blot结果进一步确定c-kit的蛋白水平的表达量在IPO组在3d最多,差异存在统计学意义(P0.05);I/R组也有相同趋势,c-kit的蛋白表达水平在7d最多,且差异存在统计学意义(P0.05)。其它两组处理组未见c-kit的表达。 RT-PCR检测发现IPO组和I/R组中,c-kit的表达量变化曲线与western blot基本相似,确定IPO组c-kit多潜能干细胞的表达量最大值出现在3d,I/R组出现在7d,且差异存在统计学意义(P0.05)。 2.2RT-PCR检测Gata-4和Mef2C的结果和c-kit的结果一致。 2.3干细胞和肥大细胞的区分。通过以上方法检测多潜能干细胞表面特异性标记物c-kit、Gata-4、Mef2C均为阳性,且表达量变化曲线基本一致,确定心肌组织内c-kit多潜能干细胞数量存在变化,而心脏肥大细胞数量变化不影响检测结果。 2.4心肌细胞增殖的可能来源的推测。通过免疫荧光技术检测α-SMA,确定成熟心肌细胞的数量,并与多潜能干细胞的数量进行相关性分析,得出两者阳性细胞数量变化有关联,推测心肌细胞增殖的可能来源为干细胞。 3、IPO干预后可以改善大鼠心功能。术后14d和30d血流动力学的变化: I/R组和IPO组LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明显低于假手术组,同时LVEDP明显高于假手术组。与I/R组比较,IPO干预后不同时间LVSP及±dp/dtmax均明显升高(p0.05),而LVEDP虽有下降趋势,但是这种变化各组时间点无统计学差异(p0.05)。 结论: 1、IPO和I/R两种方法都可以引起心肌组织细胞数量增加,且这种增殖的细胞可能来源为c-kit阳性的多潜能干细胞。 2、IPO和I/R两种方法引起c-kit阳性的多潜能干细胞增殖的高峰期不同,I/R在第7d,而IPO在第3d,且IPO较I/R能更快促使c-kit阳性的多潜能干细胞增殖。 3、初步判断c-kit阳性的多潜能干细胞数量的改变与成熟心肌细胞的数量改变有关,即在心肌受损后c-kit阳性的多潜能干细胞可能分化为成熟的心脏细胞以修复受损的心肌组织。 4、IPO处理损伤心肌后,对心肌组织的血流动力学有所恢复,改善了心功能。


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