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探讨弓形虫感染孕鼠对胎鼠脑组织蛋白的影响

赫燕侠  
【摘要】:目的:①采用不同剂量的弓形虫速殖子经腹腔接种孕中期小鼠,建立弓形虫急性感染孕鼠的动物模型;②利用弓形虫感染孕鼠的模型,观察弓形虫是否对胎鼠有毒性作用;③采用双向凝胶电泳技术,提取胎鼠脑组织的蛋白质;④利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术,鉴定染虫胎鼠脑组织是否有特异性蛋白;⑤利用生物信息学软件,对染虫胎鼠脑组织的特异蛋白进行分类和功能分析。利用以上的实验技术和生物信息学软件,来分析和探讨母代小鼠感染弓形虫,对子代脑组织是否有影响,为干预先天性弓形虫脑病和提高优生优育率提供可靠的理论依据。 方法:①建立动物模型:将9-10周龄、20±1g的BALB/c小鼠交配,查孕栓。将受孕鼠随机分为正常组(A)和感染组(B~F)6组,每组6只。于受孕第8天,正常A组孕鼠经腹腔注射无菌PBS(0.2ml/只),染虫B~F组孕鼠分别腹腔注射经胰酶消化后的弓形虫速殖子10个、20个、40个、80个和160个/0.2ml/只。观察和记录孕鼠的体重、进食量、饮水量,有无竖毛、怠动、厌食、弓背、存活等情况,计算半数致死量,确定接种孕鼠的最佳剂量。②观察弓形虫对胎鼠的毒性作用:采用受孕的BALB/c小鼠20只,随机分为正常组(A)和染虫组(B),每组各10只。于受孕第8天,正常组(A)小鼠经腹腔注射无菌PBS(0.2ml/只),染虫组(B)经腹腔注射胰酶消化后的弓形虫速殖子(最佳剂量40个/只)。在怀孕第18天处死孕鼠,剖腹取胎鼠,肉眼观察胎鼠的颜色,判断胎鼠的存活情况,记录活胎、死胎和吸收胎数,计算活胎率。称胎鼠的重量,测胎鼠的体长、尾长。同时,解剖胎鼠取脑组织,观察脑有无出血、水肿等情况,证实弓形虫是否对胎鼠有毒性作用。③采用双向凝胶电泳技术分离胎鼠脑组织蛋白:取正常组和染虫组胎鼠新鲜的脑组织,进行研磨、纯化,提取总蛋白,进行定量。再根据双向凝胶电泳原理,进行一维等电聚焦,然后根据分子量和等电点进行二向垂直分离,获取蛋白质点。采用胶图分析软件,对两组凝胶图像以不同灰度值计算比值,根据P<0.05的标准判断,从中选取差异显著的蛋白点。④利用质谱技术鉴定染虫胎鼠脑组织的特异蛋白:将差异显著的蛋白点从胶图上切取,经蛋白酶切和肽段提取,再利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析每种蛋白独特的肽指纹图谱(PMF)。用Mascot软件对图谱进行分析,根据系统打分分值的高低、分子量、等电点、序列覆盖率等信息鉴定其可靠性。⑤用生物信息学David软件分析染虫胎鼠脑组织特异性蛋白质的种类和功能:应用分析的结果,分析和探讨特异性蛋白是否与先天性弓形虫病的发生有相关性。 结果:①动物模型的结果:正常对照A组孕鼠体重增加明显,采食量、饮水量正常,在受孕期的观察中未出现竖毛、倦怠等异常反应,胎鼠发育无异常,存活率高达96.88%。染虫B组、C组孕鼠在孕期有活动量少、倦怠的现象。D组孕鼠在孕期出现采食量、饮水量减少,倦怠等症状,并有流产现象,18天剖出的胎鼠,活胎率为53.57%。E组孕鼠孕期的采食量、饮水量明显减少,有竖毛、弓背现象,体重增长缓慢;剖出的胎鼠中,死胎、吸收胎多,活胎率仅为26.09%。F组的孕鼠,体重增长不明显,弓背、竖毛现象严重;在孕18天时,已有1/3孕鼠死亡;存活的孕鼠,胎鼠均已流产。通过对胎鼠的半数致死量分析,腹腔接种经胰酶消化的弓形虫速殖子40个/只为最佳剂量。②胎鼠的毒性反应:正常A组胎鼠发育良好,仅有1例吸收胎。染虫B组的胎鼠中有死胎、吸收胎,胎鼠的体重明显减轻,身长及尾长也明显缩短,差异具有统计学意义(P<0.05)。解剖镜下观察,胎鼠有1例脑出血,1例脑水肿。通过两组比较分析,弓形虫感染母鼠可导致胎鼠的毒性反应。③胎鼠脑组织蛋白的分析:采用双向电泳的方法分析了两组胎鼠脑组织的蛋白,其正常对照组与染虫组的胎鼠脑组织均有独特的2-DE凝胶电泳图谱,且不同批次的实验重复性良好,组内的匹配率达85%以上。每块2-DE凝胶图上可以分离出约500个蛋白点。经软件对比分析,得到差异显著的蛋白点15个。④把差异表达显著的15个蛋白点用生物质谱鉴定和生物信息学软件进行分类和功能的分析:发现这些蛋白点主要是肌动蛋白、结蛋白、血清白蛋白、蛋白质二硫键异构酶、膜联蛋白和葡萄糖调节蛋白。结蛋白和肌动蛋白是维持细胞结构的蛋白;血清白蛋白具有抑制血小板聚集、抗凝血和维持血液胶体渗透压的作用;葡萄糖调节蛋白是一种应激蛋白,可保护细胞结构,有报道显示可能与小鼠的心脏和神经管发育有关;蛋白质二硫键异构酶可催化蛋白质二硫键的形成和对错配二硫键的修整;膜联蛋白参与细胞膜表面的物质转运。在弓形虫感染的鼠脑中,这些蛋白均低于正常对照组的表达。说明弓形虫感染胎鼠,对胎鼠脑组织的细胞结构和功能造成损伤,可引发先天性弓形虫脑病。 结论:①采用经胰酶消化的弓形虫速殖子40个/只腹腔接种BALB/c孕鼠,可作为弓形虫感染孕鼠生殖毒性的最佳剂量。②以40个/只经胰酶消化的弓形虫速殖子感染母代小鼠,可导致子代感染,并产生毒性反应。③弓形虫感染孕鼠可影响胎鼠脑组织蛋白的表达。④利用MADLI-TOF MS技术和生物信息学David软件分析15个特异性蛋白质,发现弓形虫感染小鼠的脑组织中,肌动蛋白、结蛋白、血清白蛋白、蛋白质二硫键异构酶、膜联蛋白和葡萄糖调节蛋白均低于正常鼠,说明弓形虫感染对宿主脑组织细胞的结构和功能有损伤作用。此研究为先天性弓形虫脑病的诊治奠定了理论基础,但需要进一步的验证。


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