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喉癌中自噬基因Beclin1的表达及对顺铂药敏的实验研究

康荣  
【摘要】:背景与研究目的 喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着患者的健康,寻找有效的治疗方法一直是临床的迫切需求,在喉癌的治疗中,基因治疗已成为手术、化疗放疗三大治疗外新的治疗手段。 自噬是细胞内成分被溶酶体降解过程的统称,在清除损伤或多余的细胞器,维持细胞内环境稳定方面起着重要作用。自噬可清除损伤的细胞器,避免如自由基等有毒性物质的产生,从而使突变率降低,抑制肿瘤的形成,而自噬的缺陷可导致肿瘤的发生。Beclin1基因是第一个被发现的哺乳动物的自噬基因,在多种肿瘤中表现为表达降低和缺失,Beclin1表达缺失明显增加肝癌、肺癌和淋巴瘤的发生率,但自噬基因Beclin1与喉癌的关系尚不清楚。 本研究通过检测喉癌组织中自噬基因Beclin1的表达,探讨自噬基因Beclin1与喉癌发生发展的关系;研究自噬基因Beclin1在喉癌Hep-2细胞中表达增强和缺失对细胞体外增殖、自噬、凋亡的作用及对喉癌Hep-2细胞顺铂敏感性的影响,探讨自噬诱导在喉癌治疗中的可行性,为喉癌的基因治疗提供新的思路。 方法: 1.采用免疫组化SP法对77例喉癌组织和22例正常喉组织进行Beclin1蛋白表达水平进行检测,分析Beclin1与喉癌临床分型、T分期、组织分化程度、淋巴结转移等临床病理因素的相关性; 2.通过RT-PCR法从人正常喉组织中获得目的基因Beclin1,将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1;设计针对Beclin1的特异性RNA干扰序列,构建Beclin1基因的小发夹状RNA (shRNA)真核表达质粒pSUPER/Beclin1; 3.脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclinl和pSUPER/Beclin1转染人喉癌细胞株Hep-2,筛选稳定表达株,采用荧光定量RT-PCR及Western Blot分别在mRNA和蛋白质水平检测转染前后Beclin1、LC3和p62蛋白的表达变化;流式细胞仪检测自噬情况;Hoechs检测细胞凋亡;MTT法检测细胞的增殖变化; 4.顺铂处理Hep-2细胞后,MDC染色检测自噬情况;将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1和pSUPER/Beclin1转染人喉癌细胞株Hep-2后,顺铂处理,MTT法检测细胞的增殖变化。 结果: 1.喉癌组织中Beclin1的蛋白表达阳性率低于正常喉组织(P0.05),喉癌中常见Beclin1表达下调和缺失;Beclin1表达与喉癌的临床分型无关(P0.05),与喉癌的T分期、分化程度及淋巴结转移相关(P0.05) 2.利用PCR分析,酶切鉴定及DNA测序证实Beclin1基因的表达质粒pcDNA3.1/Beclin1(?)PRNA干扰质粒pSUPER/Beclin1构建成功; 3. pcDNA3.1/Beclin1转染Hep-2细胞后,Beclin1、LC3Ⅱ mRNA和蛋白的表达显著提高,p62mRNA和蛋白的表达显著降低(P0.05),与未转染组相比,凋亡细胞和自噬细胞明显增加,细胞生长活性降低; 4. pSUPER/Beclin1转染Hep-2细胞后,Beclin1 LC3Ⅱ mRNA和蛋白的表达明显降低,p62mRNA和蛋白的表达显著增高(P0.05),与未转染组相比,凋亡细胞和自噬细胞明显减少,细胞生长活性增强; 5.顺铂处理Hep-2细胞后,细胞内自噬增加,且呈浓度依赖关系,重组质粒pSUPER/Beclin1可以显著提高Hep-2细胞对顺铂的敏感性。 结论: 自噬基因Beclin1与喉癌的发生、发展有关,自噬基因Beclin1可有效抑制喉癌细胞的增殖,提高肿瘤细胞的自噬和凋亡能力,同时抑制自噬基因Beclin1表达能提高喉癌Hep-2细胞对顺铂的敏感性。


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