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16SrDNA和MALDI-TOF-MS鉴定布鲁氏菌方法建立和评价

汤旭  
【摘要】:目的: 为了快速、准确、便捷的检测和鉴定布鲁氏菌,本研究建立了鉴定布鲁氏菌属的16SrDNA序列分析方法和鉴定布鲁氏菌属和种的MALDI-TOF-MS方法,利用现场分离菌株对这两种鉴定布鲁氏菌的方法进行特异性和敏感性评价。 方法: 1.第一部分 1.1用PCR扩增布鲁氏菌的16SrDNA片段,将扩增的产物纯化后测序。用BLAST程序将所测得的序列与数据库中的序列进行比较分析,寻找同源性最高的16SrDNA序列。 1.2从GenBank下载与布鲁氏菌易发生血清学交叉反应的细菌的16SrDNA序列。使用DNAMAN软件进行16SrDNA序列比对分析。 2.第二部分 2.1收集了不同时间不同地点分离的20株布鲁氏菌菌株,应用MALDI-TOF-MS采集图谱,获取独特的蛋白质指纹图谱,汇总成标准图谱,建立布鲁氏菌鉴定数据库。 2.2采用39株布鲁氏菌菌株,对建立的数据库进行验证。 2.3在数据库信息的基础上,对59株布鲁氏菌菌株进行了聚类分型。 结果: 1.第一部分 1.1所测定的布鲁氏菌株的16SrDNA序列经BLAST分析,结果显示均与布鲁氏菌的同源性最高,达到了99%以上。 1.2布鲁氏菌同与其有血清型交叉反应的菌株相比较,16SrDNA序列间有显著差异。 2.第二部分 2.1通过采集布鲁氏菌特征性指纹图谱,创建了布鲁氏菌鉴定质谱图数据库。 2.2采用39株布鲁氏菌菌株对建立的数据库进行验证,经数据库鉴定,39株布鲁氏菌菌株与数据库中布鲁氏菌的匹配分数全部大于2.300,均报告为布鲁氏菌,表明鉴定结果的可信度很高。 2.3聚类分型结果表明,在蛋白质水平,MALDI-TOF-MS将布鲁氏菌分成3大类。 结论: 16S rDNA序列分析和MALDI-TOF-MS技术是从DNA和蛋白质两个不同的方面对布鲁氏菌进行鉴定,均具有快速,准确,灵敏等优点,可以实现对布鲁氏菌属的准确鉴定。对布鲁氏菌病的临床诊断具有较高的使用价值。


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