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5-Aza-CdR对B-ALL细胞系NALM-6的作用及其对miRNA影响的研究

石懿玉  
【摘要】:背景 B系急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤,近年来儿童ALL的长期无事件生存率已达到70%-80%,但确切的分子机制仍不清楚。许多研究表明,人类DNA异常甲基化和miRNA异常表达是肿瘤发生的一个共同特征。抑癌基因启动子区过度甲基化导致了其表达水平降低或沉默,诱导细胞发生癌变。miRNA可降解靶基因mRNA或抑制其翻译,广泛地抑制靶基因的表达和抑制靶蛋白的翻译,从而参与调控细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)是DNA甲基转移酶的抑制剂,本研究利用5-Aza-CdR处理B-ALL细胞系NALM-6,以降低细胞整体DNA甲基化水平,在此基础上探讨miRNA的改变。以期为B-ALL发生过程中DNA甲基化与miRNA的相关性提供理论基础,为后续治疗提供新的思路。 研究目的 1、探索5-Aza-CdR对NALM-6细胞增殖、细胞凋亡的影响,以及对细胞中Dnmts表达水平的影响。 2、筛查NALM-6细胞去甲基化作用下表达量发生改变的miRNA; 3、预测发生改变的miRNA靶基因。 研究方法 1、MTT法检测不同浓度5-Aza-CdR作用不同时间对NALM-6细胞增殖的作用。流式细胞术检测不同浓度5-Aza-CdR对细胞凋亡的影响。采用荧光定量RT-PCR检测5-Aza-CdR处理后细胞Dnmts基因mRNA表达水平变化。 2、采用miScript miRNA PCR Array芯片检测去甲基化后细胞中表达量发生改变的miRNA。 3、通过PicTar、TargetScan、MiRDB和miRTarBase4种软件预测发生改变的miRNA靶基因。 结果 1、NALM-6细胞经不同浓度5-Aza-CdR处理不同时间后,细胞生长受抑,并出现早期凋亡,当浓度加大时,早期凋亡减少,晚期凋亡或死亡数增加。 2、5-Aza-CdR作用浓度与Dnmts基因mRNA表达水平呈反比。 3、miScript miRNA PCR Array筛出3个miRNA(miR-184,miR-23a-3p,miR-34a-5p)与DNA甲基化相关。 4、软件预测得到9个上述miRNA的靶基因。 结论 1、5-Aza-CdR能够抑制B-ALL细胞NALM-6的增殖,促进该细胞早期凋亡。 2、5-Aza-CdR通过下调Dnmts基因表达发挥去甲基化作用。 3、miR-184,miR-23a-3p和miR-34a-5p在B-ALL的发生发展中与DNA甲基化相关。 4、CXCL12,POU4F2,IL6R,PDGFRA,MAP2K1,FOXP1,NUS1,SF1,EPB41L5这9个基因可能通过甲基化的作用方式与B-ALL相关。


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