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筛选吴茱萸中的β_1肾上腺素受体抑制剂及考察其对缺血心肌能量代谢的改善作用

薛晖  
【摘要】:目的:持久地兴奋β1肾上腺素受体(β1-AR)会使心肌收缩增强,心率加快,最终导致心肌能量代谢紊乱、ATP供应不足,心肌功能受损。本课题利用β1肾上腺素受体细胞膜色谱法(β1-AR/CMC)筛选吴茱萸中与β1-AR相结合的活性成分,再将活性成分用超高效液相-质谱(UPLC/MS)进行鉴定,得到吴茱萸中对β1-AR具有抑制作用的活性成分;并通过动物的体内药理实验评价活性成分对缺血心肌能量代谢方面的改善作用。方法:首先,利用本实验室前期构建的β1-AR高表达的中国仓鼠卵巢S亚型(CHO-S)细胞,制备细胞膜色谱柱,建立β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS分析方法;并通过比较美托洛尔(metoprolol)和地西泮(DZ)在该系统上的保留行为考察分析方法的可行性;分别制备吴茱萸95%乙醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷提取物,将以上提取物制备后,分别注入β1-AR/CMC色谱系统进行分析,收集β1-AR/CMC上的保留组分;在优化条件下将其注入UPLC/MS系统进行分析,对其中的活性成分进行鉴定。其次,采用异丙肾上腺素(ISO)损伤β1-AR/CHO-S细胞;给予不同浓度的活性成分干预,观察β1-AR激活后,其下游因子环磷酸腺苷(c AMP)、蛋白激酶A(PKA)等表达水平的变化,评价活性成分对β1-AR的抑制作用。最后,建立在体大鼠I/R损伤模型,采用股静脉注射药物进行干预,考察活性成分对I/R损伤大鼠能量代谢的改善作用。再灌注结束后,采用Evans-Blue/TTC双染法测定大鼠心肌梗死面积,依据试剂盒测定血清中葡萄糖、乳酸(LD)、游离脂肪酸(FFA)、乳酸脱氢酶(LDH)等能量代谢底物的变化,ELISA法测定心肌组织中ATP的含量、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的含量以及Ca2+-ATPase的活性,初步评价活性成分对I/R大鼠心肌能量代谢的改善作用。结果:β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS方法的可行性考察结果显示,β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS系统专属性地对β1-AR抑制剂metoprolol有强的选择性(tR=7.3 min),且metoprolol在同一个高表达的β1-AR/CMC色谱柱上的保留时间(tR)的RSD为1.52%(n=6),在三个不同的高表达的β1-AR/CMC色谱柱上的保留时间(tR)的RSD为7.84%(n=3)。利用β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS方法对95%乙醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷提取物进行筛选,结果显示95%乙醇提取物中存在与β1-AR/CMC系统相互结合的活性成分,经UPLC/MS鉴定为吴茱萸碱(Evo)和吴茱萸次碱(Rut)。体外及体内药理实验结果显示:(i)Evo(1μM)和Rut(5μM)可以显著降低ISO损伤β1-AR/CHO-S细胞的c AMP和PKA水平(P0.01 vs ISO);(ii)Evo(0.1 mg/kg)和Rut(0.1 mg/kg)可明显减少心肌梗死面积;减少血清FFA的含量,葡萄糖的含量及LD的含量,明显升高心肌组织中ATP的含量,增强Ca2+-ATPase活性,抑制心肌组织中PPARα的生成。研究结果表明Evo和Rut能够改善I/R损伤大鼠心肌对FFA与葡萄糖的利用,改善了糖脂代谢的紊乱,提高了心肌能量的供应,对I/R损伤心肌起到修复与能量改善作用。结论:本文所建立的β1AR/CMC-Offline-UPLC/MS分析方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性高、分析速度快的特点,能够应用于吴茱萸中β1-AR抑制剂的筛选。该方法为从中药、生物样品等复杂体系中有效地筛选活性成分提供了平台。同时,体内药理实验从能量代谢方面初步探讨了活性成分Evo和Rut对缺血心肌的改善作用,其作用机制可能为抑制β1-AR的激活及降低PPARα的含量,该结果为研究吴茱萸保护缺血心肌的作用机制提供了新的作用靶点与研究思路,为治疗缺血性心脏病、心肌梗死等冠心病开辟了新的领域。


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