GP73抗体修饰阳离子脂质体介导HSV-tk基因对肝癌细胞的选择性杀伤作用研究

【摘要】：目的:1.筛选肝癌细胞和其他非肝癌细胞表面高尔基体膜蛋白73(GP73)阳性表达率,确定GP73在肝癌细胞表面表达的特异性;2.制备普通阳离子脂质体;3.将普通阳离子脂质体(lipoplexes)与GP73抗体偶联,构建一种新型的由GP73抗体修饰的能够特异性结合肝癌细胞的靶向治疗载体;4.制备不同剂量的GP73抗体修饰脂质体,转染Hep G2肝癌细胞,流式细胞术筛选转染率最高的GP73抗体修饰组,确定脂质体中GP73抗体的最佳负载量;5.比较GP73抗体修饰的脂质体和普通阳离子脂质体对人肝癌细胞株Hep G2、Bel-7402、SMMC-7721和人正常肝细胞HL-7702以及人非肝癌细胞SW480和正常人胚肾细胞HEK293T的转染效率;6.研究由GP73抗体修饰的阳离子脂质体介导的HSVtk自杀基因联合更昔洛韦(GCV)对肝癌细胞的体外杀伤作用;7.研究由GP73抗体修饰的阳离子脂质体介导的HSVtk自杀基因联合GCV对肝癌荷瘤裸鼠体内肿瘤的杀伤作用。方法:1.用GP73的一抗(Anti-GOLPH2)连接二抗FITC分别孵育细胞Hep G2、SMMC-7721、Bel-7402、HL-7702、Hela、SW480和HEK293T,通过流式细胞仪检测细胞表面GP73的阳性表达率。2.乙醇注入法和挤压法联合制备普通阳离子脂质体(实验室前期制备方法)。3.将GP73抗体与阳离子脂质体偶联,制备GP73抗体修饰的脂质体。4.将普通阳离子脂质体和GP73抗体修饰脂质体分别与p Genesil-1质粒混匀、孵育,确定最佳的包裹比例。5.制备含量不同的GP73抗体修饰的阳离子脂质体,转染Hep G2肝癌细胞,流式细胞术筛选转染率最高的GP73抗体修饰脂质体组,确定脂质体中GP73的最佳负载量。6.分别使用GP73抗体修饰的阳离子脂质体转染p Genesil-1质粒,流式细胞仪检测Hep G2、Bel-7402、SMMC-7721、HL-7702、Hela、SW480、HEK293T细胞的报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。7.用GP73抗体修饰的阳离子脂质体携带p Survivin-TK-PBI-CMV2质粒分别转染细胞Hep G2、Bel-7402和HL-7702,48小时后提取细胞的总RNA和总蛋白,并通过RT-PCR、Westernblot技术方法检测细胞中HSVtk基因的m RNA和蛋白表达水平。8.用GP73抗体修饰的阳离子脂质体携带p Survivin-TK-PBI-CMV2质粒分别转染肝癌细胞Hep G2、Bel-7402和肝正常细胞HL-7702,加入浓度为150μg/m L的前体药物GCV处理24 h,经流式细胞仪检测细胞凋亡情况。9.梯度剂量的GCV处理转染后的肝癌细胞48小时,MTT法检测HSVtk自杀基因系统对肝(癌)细胞生存率的影响情况。10.用生长状态良好的Hep G2肝癌细胞接种裸鼠成瘤,利用公式V=ab2/2,(a代表瘤体最长径,b代表瘤体最短径)计算瘤体积。11.HE染色检测干预后三组肿瘤组织坏死情况。12.TUNEL凋亡试剂盒检测干预后三组肿瘤组织细胞凋亡情况。13.裸鼠开始治疗后,观察裸鼠生长状态,并持续40天记录裸鼠存活状态,用Graphpad Prism v 6.0软件分析数据,绘制生长曲线图谱,比较三组荷瘤裸鼠生存期。结果:1.通过对细胞表面GP73阳性表达率的筛选,肝癌细胞Hep G2、Bel-7402、SMMC-7721细胞表面GP73阳性率高于HL-7702、Hela、SW480、HEK293T,差异有统计学意义(P0.05),表明了GP73在肝癌细胞表面表达有特异性;2.制备了一种普通阳离子脂质体;3.制备了一种GP73抗体修饰的能够特异性结合肝癌细胞的靶向治疗载体(Anti GP73-lipoplexes);4.GP73抗体修饰的脂质体对人肝癌细胞株Hep G2、Bel-7402和SMMC-7721的转染效率明显高于肝正常细胞和非肝癌细胞(P0.05);5.基因和蛋白水平检测表明,HSVtk基因在Hep G2和Bel-7402肝癌细胞中有表达,而在肝正常细胞HL-7702中未见表达;6.细胞增殖实验(MTT)结果可见,Hep G2和Bel-7402肝癌细胞转染组在GCV浓度不断增加的情况下,细胞存活率不断下降,与未转染加药组和正常肝细胞HL-7702相比有统计学差异(P0.05);7.流式细胞仪(FC 500)检测凋亡结果表明Hep G2、Bel-7402肝癌细胞死亡率明显高于肝正常细胞组(P0.05);8.肝肿瘤裸鼠造模成功,肿瘤体积达160~200 mm3;9.免疫组化和TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡结果表明,Anti GP73-lipoplexes运载HSVtk基因联合GCV治疗组肿瘤组织细胞凋亡明显,而lipoplexes+HSVtk+GCV组有少量细胞凋亡,空载组(lipoplexes+Vector+GCV)几乎未见凋亡细胞;10.生存曲线分析表明Anti GP73-lipoplexes+HSVtk+GCV治疗组裸鼠生存期明显长于对照组(P0.05)。结论:1.肝癌细胞Hep G2、Bel-7402和SMMC-7721表面GP73阳性表达率高于肝正常细胞和非肝癌细胞。2.GP73修饰的阳离子脂质体(GP73-lipoplexes)载体运输系统成功构建。3.Anti GP73-lipoplexes对肝癌细胞具有较高的转染效率。4.Anti GP73-lipoplexes介导自杀基因真核表达质粒p Survivin-TK-PBI-CMV2在GP73阳性高表达的Hep G2、Bel-7402肝癌细胞内成功表达。5.在细胞水平:Anti GP73-lipoplexes介导SUR启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对Hep G2、Bel-7402肝癌细胞具有选择性杀伤作用,对正常肝细胞HL-7702没有杀伤作用。6.Hep G2肝癌细胞异种移植瘤裸鼠接种成功。7.在动物水平:Anti GP73-lipoplexes介导SUR启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对Hep G2肝癌细胞异种移植瘤裸鼠肿瘤的生长与增殖有抑制作用,而且能够延长治疗组荷瘤裸鼠的生存期。