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明胶微载体复合脂肪间充质干细胞构建3D细胞球在组织工程神经中的研究

刘平  
【摘要】:目的:1)探讨基于明胶微载体3D细胞培养的优势。2)研究基于明胶微载体构建3D细胞球在组织工程神经中对神经再生的修复效果。方法:取(48小时)SD乳鼠腹股沟脂肪,剪碎消化后进行培养,培养到P1代,然后将明胶微载体复合P1代脂肪干细胞(adipose-derived stem cells ADSCs)在生物反应器中进行3D动态培养构建3D细胞球。在体外,为了评价3D细胞培养的优势,本实验从增殖、凋亡、干细胞基因的维持以及干细胞功能方面进行比较。取P1代ADSCs 50 x 10~4个分别进行传统的2维(2 Dimension 2D)以及3D培养,培养时间分别为1,3,5,7天,在这4个时间点中分别取2D,3D培养的细胞进行细胞计数,用PCR检测干细胞干性基因的表达情况,并用凋亡试剂盒(FITC/PI)检测两种不同培养方式细胞的凋亡情况。而干细胞的功能比较时,将构建好的3D细胞球以及2D培养的细胞分别放入transwell的上层与背根神经节共培养,对比2D,3D两种细胞对背根神经节轴突生长的效果。在体内,建立大鼠坐骨神经缺损的模型(n=48),长度为15mm,随机分成4组,分别注射入3D细胞球(3D组),2D细胞(2D组),单纯壳聚糖导管组(chitosan conduit,conduit组)以及自体神经(autologous nerve grafts,autogrft组)桥接神经缺损。术后观察12周后取材,通过神经电生理、腓肠肌肌肉湿重恢复率以及组织学分析(甲苯胺蓝染色、免疫荧光染色、透射电镜扫描)等方法对比评价3D脂肪干细胞球作为种子细胞注射入壳聚糖导管中修复大鼠坐骨神经缺损的效果。结果:基于明胶微载体的3D细胞动态培养与传统的2D细胞培养相比,细胞增殖能力更快,使细胞凋亡速度减慢,对干细胞干性基因表达的维持能力更强。3D细胞球较2D细胞更能够加速DRG轴突的生长。术后12周取材,3D组和autograft组的神经电生理、腓肠肌肌肉湿重恢复率及病理学观察等检测的结果都要明显优于2D和conduit组;3D组和autograft组比较存在明显的差异,且后者明显优于前者;但2D和conduit组之间统计学差异不显著。结论:本实验基于明胶微载体构建3D细胞球进行动态细胞培养具有细胞增殖能力快、降低凋亡速率、更好的维持干细胞的干性以及提高了干细胞的功能,能够很好的充当干细胞应用到组织工程神经研究中,其疗效明显优于2D细胞组。


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