地西泮中毒标志物的法医毒物动力学研究

【摘要】：目的:1.建立地西泮中毒标志物Ⅱ相代谢物葡萄糖醛酸苷的制备方法;2.研究地西泮中毒标志物Ⅱ相代谢物葡萄糖醛酸苷的分解动力学规律,明确样品保存方式和检测时限;3.基于非靶标代谢组学技术筛选地西泮中毒标志物,为其相关的法医毒物动力学研究提供依据。方法:1.地西泮Ⅱ相代谢物葡萄糖醛酸苷的制备采用肝微粒体孵育和尿液直接提取法,用HPLC-MS/MS检测方法,检测体系中葡萄糖醛酸化情况。将代谢产物与去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷和羟基西泮葡萄糖醛酸苷标准品对比,确定其化合物信息及归属。2.地西泮Ⅱ相代谢物葡萄糖醛酸苷的分解动力学男、女志愿者各三名,于服药后24 h取血液4份,每份10 mL,分别置于室温20℃、4℃、-20℃和室温添加1%NaF的肝素钠真空管中。同时,对每种条件下血液样本各留取12个100μL,分别滴于滤纸中央,待其扩散完毕,晾于室温下至少2 h以制作血痕标本;志愿者服药后48 h取尿液4份,每份10 mL,分别置于室温20℃、4℃、-20℃和室温添加1%NaF的塑料离心管中,同时制作尿痕样本(方法同血痕)。质谱分析不同时间点各个样本中地西泮及其I、Ⅱ相代谢物的含量。3.非靶标代谢组学在地西泮中毒标志物筛选及其动力学研究中的应用对地西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、硝基西泮、艾司唑仑和阿普唑仑急性中毒大鼠和空白对照大鼠的代谢物质谱图信息进行数据预处理、PCA分析、差异化合物鉴定等分析,得到各自代谢指纹图。结合图谱比对,通路分析,研究各苯二氮?类药物急性中毒的潜在生物标志物,筛选地西泮急性中毒的潜在生物标志物。结果:1.地西泮Ⅱ相代谢物葡萄糖醛酸苷的制备经质谱分析,利用肝微粒体合成所得目标物的质谱行为与去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷标准品比对相对误差和利用尿液提取法所得目标物质谱行为与去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷和羟基西泮葡萄糖醛酸苷标准品比对相对误差均在其最大允许相对误差范围(25%)之内,可以确定两种方法均可以制备出相应的葡萄糖醛酸结合物。2.地西泮Ⅱ相代谢物葡萄糖醛酸苷的分解动力学地西泮Ⅱ相代谢物葡萄糖醛酸苷在血液、尿液中的变化一致,均表现出随时间上升的趋势,且与保存条件无关;而在血痕、尿痕中的表现差异较大,具体表现为:血痕中羟基西泮葡萄糖醛酸苷比较稳定,且与保存条件无关;而尿痕中羟基西泮葡萄糖醛酸苷除在20℃组有缓慢降解的趋势外,在20℃(1%NaF)、4℃和-20℃条件下也均比较稳定;去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷在血痕中的含量不同保存条件下均有降低,而在尿痕中则表现为随时间变化的升高,且与保存条件亦无关联。3.非靶标代谢组学筛选地西泮中毒的潜在生物标志物地西泮代谢组学研究发现,地西泮中毒大鼠血浆中差异化合物有泛酸和5-氧脯氨酸,尿液中差异化合物有柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、琥珀酸半醛、L-苏氨酸和4-胍基丁酸,与其他五种苯二氮?类药物相比,地西泮急性中毒后,大鼠血浆中5-氧脯氨酸含量变化较为突出,其涉及的代谢通路主要为谷胱甘肽。结论:1.本实验建立了应用肝微粒体孵育和地西泮中毒模型尿液分离制备地西泮葡萄糖醛酸苷Ⅱ相代谢物的方法,可用于地西泮葡萄糖醛酸苷Ⅱ相代谢物的相关研究;2.本实验构建了同步提取和测定血痕、尿痕中地西泮及其I、Ⅱ相代谢物的HPLC-MS-MS检测方法,LOQ、线性范围、回收率等均满足分解动力学的研究要求,可以用于血痕、尿痕中地西泮Ⅱ相代谢物葡萄糖醛酸苷的分解动力学研究;3.分解动力学研究显示地西泮及其代谢物在同一体系中的稳定性会受到多种因素的干扰。其中,保存在1%NaF、4℃或者-20℃条件下的血痕、尿痕中羟基西泮葡萄糖醛酸苷则相对比较稳定。4.本实验用非靶标代谢组学技术,初步探讨了地西泮急性中毒大鼠血浆、尿液中可能存在的地西泮中毒标志物,结果发现血浆中5-氧脯氨酸含量变化较为明显,其主要涉及的通路为谷胱甘肽代谢,为后续的靶标代谢组学及其相关的法医毒物动力学研究提供了依据。